響應(yīng)面法優(yōu)化隱甲藻產(chǎn)DHA的培養(yǎng)基

響應(yīng)面法優(yōu)化隱甲藻產(chǎn)DHA的培養(yǎng)基

梅志剛¹，王菊芳^2，*

（華南理工大學(xué)  生物科學(xué)與工程學(xué)院  廣東  廣州  510006）

摘要：利用響應(yīng)面法優(yōu)化隱甲藻產(chǎn)DHA的培養(yǎng)基，在8種因素的單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選出葡萄糖和胰蛋白粉為顯著影響因子，維持其它組分濃度在低水平不變，對(duì)以上兩因子爬坡逼近最大響應(yīng)區(qū)域后利用中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析得到最高點(diǎn)和主要因子的濃度。優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成為：葡萄糖30.54g/L, 胰蛋白粉5.03g/L，酵母粉4g/L，甘油20g/L，不添加MgCl₂和維生素溶液，其他組分同460培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基條件下，DHA產(chǎn)量達(dá)到907.54±1.02mg/L，是優(yōu)化前產(chǎn)量的2.48倍。

關(guān)鍵字：隱甲藻，DHA，響應(yīng)面

 

Response surface method for optimization of medium composition of Crypthecodinium.cohnii for DHA production

MEI Zhi-gang¹, WANG Ju-fang^2,*

Abstract: On the basis of single-factor experiments, eight factors were selected for response surface method for optimization of medium composition of Crypthecodinium cohnii. The results showed that glucose and tryptone were the significant factors by using Plackett-Burman design and other components were kept at the low concentration. Then the steepest ascent experiment was designed for the significant factors (glucose and tryptone) to reach the largest region, highest point and the concentrations of those significant factors were obtained by central composite experiments and response surface analysis. The optimized medium were as follows: glucose 30.54g/L, tryptone 5.03g/L,yeast 4g/L，glycerin 20g/L,without MgCl₂ and Vitamin solution, other components are the same with the 460 medium. After medium optimization, the DHA productivity was 907.54±1.02mg/L, as much as 2.48 times of that in primary medium.

Key words: crypthecodinium.cohnii; DHA; response surface

 

DHA(docosahexaenoic acid)是一種ω-3系列多不飽和脂肪酸，具有增強(qiáng)記憶，提高智力,降低血脂，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功效，已經(jīng)應(yīng)用于臨床和流行病學(xué)和食品添加劑^[1,4]。20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)，隱甲藻具有較高的產(chǎn)DHA能力^[2]，脂肪酸積累量高于20%，DHA含量占總脂肪酸的30%~50%，是一種高效的DHA生產(chǎn)菌^[2,3]，來(lái)源于隱甲藻的DHA克服了傳統(tǒng)魚油DHA所帶有的魚腥味、富含EPA、成本高等缺點(diǎn)^[6]，美國(guó)哥倫比亞Mertek公司已用該菌種實(shí)現(xiàn)了規(guī)模化生產(chǎn)。

 

雖然目前微藻生產(chǎn)DHA已工業(yè)化，但生物量和DHA的產(chǎn)量都相對(duì)較低^[3]，人們?cè)噲D用多種方法去提高DHA產(chǎn)量，有優(yōu)化光照條件，添加氧載體，尋找優(yōu)良培養(yǎng)基成分，改造油脂性能等^[4]如何實(shí)現(xiàn)隱甲藻的高密度發(fā)酵是DHA生產(chǎn)的關(guān)鍵，各種培養(yǎng)基對(duì)隱甲藻培養(yǎng)產(chǎn)DHA影響較大，培養(yǎng)基優(yōu)化是必要的^[4,5]。

 

發(fā)酵培養(yǎng)基是多成分，而且成分之間可能相互影響，單靠單因素和正交試驗(yàn)很難很快得到較好較嚴(yán)密的結(jié)果。單因素，Plackett-Burman，最陡爬坡，中心組合設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析的依次設(shè)計(jì)是建立在多因素，多水平基礎(chǔ)上，突出重要因子，步步逼近最大響應(yīng)區(qū)，分析任何因子的一次項(xiàng)，平方項(xiàng)和任何兩個(gè)因子間的一級(jí)交叉作用項(xiàng)的數(shù)學(xué)模型，近年來(lái)在培養(yǎng)基優(yōu)化上使用很廣。本文采取了用響應(yīng)面的方法對(duì)培養(yǎng)基優(yōu)化，以期提高隱甲藻的生物量并提高DHA產(chǎn)量。

 

 

1.1藻種：Crypthecodinium. cohnii ATCC 30556 由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物研究所提供。

 

1.2培養(yǎng)基： 460（A₂E₆） 培養(yǎng)基(L^-1)如下：NaCl 23.48g，MgCl₂·6H₂O 10.63g，CaCl₂1.11g，Na₂SO₄3.92g，KCl 0.66g，NaHCO₃ 0.19g，H₃BO₃ 0.03g，SrCl₂·6H₂O 0.04g，Metal Mixture 3.0ml，F(xiàn)eCl₃·6H₂O 0.01g，甘油磷酸鈉0.15g，Tris Buffer 3.0g，Vitamin solution 1.0ml，K₂HPO₄ 0.01g，Glucose 3.0g，甘氨酸1.5g。其中Metal Mixture如下：EDTA1.0g，F(xiàn)eCl₃·6H₂O 0.05g，H₃BO₃ 1.0g，MnCl₂·6H₂O 0.15g，ZnCl₂ 0.01g，CoCl₂·6H₂O 0.005g，H₂O 100mL。Vitamin solution如下：Biotin 0.003g，Thiamine 1g，H₂O 1L。

 

 

1.3.1菌種活化，培養(yǎng)及收集：取4℃保藏的菌種10%接入裝液量5mL試管，25℃，150r/min培養(yǎng)兩天后5%接種量轉(zhuǎn)接到裝液量10mL的搖瓶，25℃，150r/min培養(yǎng)兩天作為實(shí)驗(yàn)的種子液。種子液以5%接種量接入裝液量50mL的250mL搖瓶，25℃，150r/min培養(yǎng)5天收集菌體。10000r/min離心10min,蒸餾水清洗3次。-40℃，0.317帕，凍干稱量至恒重。

 

1.3.2 脂肪酸提�。焊倪M(jìn)的Bligh--Dyer法^[9,10]。

 

1.3.3脂肪酸甲脂化^[13]

 

1.3.3色譜檢測(cè)條件：采用Agilent 7890A氣相色譜儀，F(xiàn)ID檢測(cè)器，19091N-113 HP-INNOWAX毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25μm)；載氣為N₂，進(jìn)樣口溫度250℃，檢測(cè)器溫度300℃。程序升溫，130℃保溫1 min，以5℃/min升溫到250℃保溫8 min，總運(yùn)行時(shí)間33.00 min。

 

1.3.4計(jì)算方法^[11]：每個(gè)點(diǎn)做三次平行取平均值，數(shù)據(jù)處理和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別在Excel和Minitab輔助下完成

 

1.4單因素實(shí)驗(yàn)^[7]：以460medium為基礎(chǔ)，外加甘油，酵母粉，胰蛋白粉，乙醇，研究其中含量較多和重要的8種成分，為PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)作參考。

 

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取對(duì)DHA產(chǎn)量影響較大的8個(gè)因素，進(jìn)行12次的Packett-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，篩選出重要影響因子。

 

對(duì)篩選出的因子根據(jù)方程進(jìn)行最陡爬坡設(shè)計(jì)，以坡的最高點(diǎn)作為后續(xù)中心組合的中心點(diǎn)。

 

根據(jù)Box-Behnken的中心組合原理，設(shè)計(jì)合適的水平，中心點(diǎn)重復(fù)多次，用Minitab軟件分析，對(duì)得到的理論最高點(diǎn)做3次重復(fù)驗(yàn)證。

 

 

對(duì)葡萄糖，甘油，乙醇，胰蛋白粉，酵母粉，氯化鈉，氯化鎂，維生素溶液8因子進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明以上組分濃度分別為30(g/L)，20(g/L)，5(g/L)，5(g/L)，5(ml/L)，24g/L，10.4g/L，1ml/L時(shí)DHA產(chǎn)量分別達(dá)到最高為： 521.3±1.12(mg/L)，626.24±1.02(mg/L)，709.54±1.02(mg/L)，759.07±1.12(mg/L)， 812.78±1.12(mg/L)，835.32±0.98(mg/L)，855.77±1.02(mg/L)，860.12±1.00(mg/L)。依此為Packett-Burman設(shè)計(jì)合理的濃度水平，其中原始460培養(yǎng)基DHA產(chǎn)量365.48±1.12(mg/L)。

 

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，所選8因子對(duì)菌體量和DHA產(chǎn)量都較大影響，利用PB兩水平對(duì)培養(yǎng)基8種成分進(jìn)行考察，篩選重要因子，確定最佳方案，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

 

表1　PB試驗(yàn)因素與水平

	A(g/L)	B(g/L)	C(g/L)	D(g/L)	E(ml/L)	F(g/L)	G(g/L)	H(ml/L)
	葡萄糖	甘油	酵母粉	胰蛋白粉	乙醇	氯化鈉	六水氯化鎂	Vitamin
-1	20	20	4	4	4	24	10.4	1
1	25	25	5	5	5	30	13	1.25

 

Packett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，用Minitab軟件分析PB實(shí)驗(yàn)見(jiàn)表3，在99%置信區(qū)間下，A(葡萄糖)和D（胰蛋白粉）為影響顯著因子。同時(shí)得到一次回歸模型方程：Y= 851.236 +11.049A+ 6.306B+5.993C+17.99D-2.23E -6.269F -1.051G +0.289H （1），復(fù)相關(guān)系數(shù)R²=99.16%，擬合很好，8個(gè)因子對(duì)響應(yīng)值的影響大小依次是：胰蛋白粉＞葡萄糖＞甘油＞氯化鈉＞酵母粉＞乙醇＞氯化鎂＞維生素溶液。

 

表2　PB試驗(yàn)方案與結(jié)果

 

表3　因素影響效果分析

       *”表示在99%置信區(qū)間內(nèi)顯著

 

根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)可知，除了A(葡萄糖)和D（胰蛋白粉）以外，其他因子在99%的置信區(qū)間內(nèi)DHA產(chǎn)量沒(méi)有顯著影響，E（乙醇），G（六水氯化鎂），H（維生素溶液）效應(yīng)值非常小，可以不加，所以維持其他組分保持低水平，對(duì)A(葡萄糖)和D（胰蛋白粉）進(jìn)行最陡爬坡。由表4可知，最優(yōu)條件在第五處理附近，因此以A(葡萄糖)濃度30g/l，D（胰蛋白粉）濃度5.0g/l作為后續(xù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)。  

 

表4  最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

處理	A	D	DHA(mg/L)
1	22	4.2	850.30±1.12
2	24	4.4	855.92±1.20
3	26	4.6	859.01±0.90
4	28	4.8	882.53±1.02
5	30	5.0	895.14±1.58
6	32	5.2	890.76±1.01
7	34	5.4	885.60±1.03
8	36	5.6	870.46±1.08
9	38	5.8	848.72±1.06
10	40	6.0	814.23±1.01

 

根據(jù)爬坡試驗(yàn)得到的中心點(diǎn),對(duì)A和B進(jìn)行中心試驗(yàn)組合設(shè)計(jì)。為使擬合方程具有旋轉(zhuǎn)性和通用性,中心點(diǎn)重復(fù)5次，星號(hào)臂長(zhǎng)γ= 1.414。自變量水平及編碼見(jiàn)表5，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表6 。        

             

表5  中心組合實(shí)驗(yàn)的變量和水平

因子（g/L）	水平
	-1.414	-1	0	1	1.414
A(葡萄糖)	27.2	28	30	32	32.8
D（胰蛋白粉）	4.78	4.8	5	5.2	5.52

 

表6　中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

 

　                圖1 響應(yīng)面分析法(A,D)立體分析圖A和相應(yīng)的等高線圖B

 

通過(guò)Minitab軟件分析，各個(gè)因子的的偏回歸系數(shù)估計(jì)值及方差分析結(jié)果見(jiàn)表7

 

表7　回歸方程中回歸系數(shù)的估計(jì)值及方差分析

項(xiàng)	系數(shù)	T	P
常量	907.003	1632.109	＜0.0001*
A	5.352	12.182	＜0.0001*
D	2.977	6.776	0.0003*
A*A	-9.258	-19.650	＜0.0001*
D*D	-6.439	-13.666	＜0.0001*
A*D	-3.291	-5.297	0.0011*

              *”表示在99%置信區(qū)間內(nèi)顯著

 

由此表可得到擬合的全變量編碼水平的二次回歸方程為:

Y=907.003+5.352A+2.997D-9.258A²-6.439D²-3.291A*D  （2）

該模型方程相關(guān)系數(shù)R²=0.9906，擬合很好。二次項(xiàng),一次項(xiàng)和交叉項(xiàng)都影響顯著。二次項(xiàng)系數(shù)為負(fù)，說(shuō)明拋物面開(kāi)口向下，有最大值。為了更直觀地描述兩因子對(duì)響應(yīng)值的影響，做出模型（2）的等高線和曲面圖（圖1）。由此確定的A(葡萄糖)和D(胰蛋白粉)最佳濃度為30.54g/L和5.03g/L，DHA產(chǎn)量最大907.94mg/L。為了證實(shí)預(yù)測(cè)值和真實(shí)值之間的擬合程度，以預(yù)測(cè)濃度再做三次重復(fù)驗(yàn)證，生物量和DHA平均值為8.91±0.11g/L，907.54 ±1.02 mg/L擬合良好。從而確定最佳培養(yǎng)基的組成為30.54g/L，甘油20g/L，胰蛋白粉5.03 g/L，酵母粉4 g/L，不添加氯化鎂和維生素，其他組分濃度同460培養(yǎng)基。

 

 

1原始的460培養(yǎng)基隱甲藻的生物量和DHA產(chǎn)量分別是3.32±0.12（g/L），365.48±1.12(mg/L)，通過(guò)培養(yǎng)基相關(guān)成分的篩選，得到一次擬合方程Y= 851.236 +11.049A+ 6.306B+5.993C+17.99D-2.23E -6.269F -1.051G +0.289H。所選的8種成分里葡萄糖和胰蛋白粉是顯著影響因子，該結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)^[11,13]的報(bào)道一致。

 

2對(duì)篩選的顯著效應(yīng)因子葡萄糖和胰蛋白粉進(jìn)行爬坡實(shí)驗(yàn)，不添加乙醇，氯化鎂，維生素溶液，其他因子濃度保持在低水平，在處理5達(dá)到最大，此時(shí)葡萄糖和胰蛋白胨濃度分別為30g/L和5g/L，隱甲藻生物量和DHA產(chǎn)量分別達(dá)到8.88±0.24（g/L），895.14±1..58（mg/L），并以此為后續(xù)中心組合設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

 

3根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)，確定2因素3個(gè)水平得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Minitab分析，得到回歸方程：Y=907.003+5.352A+2.997D-9.258A²-6.439D²-3.291AD，該方程擬合良好，求解出葡萄糖和胰蛋白粉的濃度為30.54g/L，5.03g/L, DHA產(chǎn)量理論值為907.94mg/L。為了證實(shí)預(yù)測(cè)值和真實(shí)值之間的擬合程度，以預(yù)測(cè)濃度再做三次平行，生物量和 DHA分別為8.91±0.11g/L和907.54±1.02 mg/L，分別是優(yōu)化前2.68和2.48倍，與理論值擬合良好，說(shuō)明有實(shí)際指導(dǎo)作用。

 

4通過(guò)單因素，PB，最陡爬坡，Box-Behnken中心組合的依次設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)比純粹的單因素和正交實(shí)驗(yàn)在理論水平上精細(xì)，嚴(yán)密，這樣可以逐漸縮小優(yōu)化范圍，快速接近優(yōu)化點(diǎn)而且能準(zhǔn)確地用方程描述最佳控制條件^[14]。

 

[1]Lloyd A Horrocks, Young K Yeo_·Health benefits of docohexaenoic acid (DHA) [J].Pharmacological Research, 1999,40(3):211-225

[2]Sijtsma L, M E de Swaaf.Biotechnological production and applications of the w-3 polyunsaturated fatty acid docosahexaenoic acid[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2004,64: 146-153

[3]Colin Ratledge. Fatty acid biosynthesis in microorganisms being used for single cell oil production [J].Biochimie, 2004,86: 807-815

[4]Teresa Lopes da Silva ·Alberto Reis. The use of multi-parameter flow cytometry to study the impact of  n-Dodecanese  additions to marine din flagellate micro alga Crypthecodinium cohnii batch fermentations and DHA production.[J]. J Ind Microbiol Biotechnol (2008) 35:875–887

[5] Colin Ratledge, K. Kanagachandran, Alistair J. Anderson,et al. Production of Docosahexaenoic Acid by Crypthecodinium cohnii Grown in a pH-Auxostat Culture with Acetic Acid as Principal Carbon Source[J]. Lipids, 2001,36(11 ):1241-1246

[6]Ana Mendes,Pedro Guerra,Vaˆnia Madeira,et al. Study of docosahexaenoic acid production by the heterotrophic micro alga Crypthecodinium cohnii CCMP 316 using carob pulp as a promising carbon source.[J]. World J Microbiol Biotechnol (2007) 23:1209-1215

[7]王菊芳,梁世中,陳峰.碳源對(duì)隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)生長(zhǎng)及DHA產(chǎn)量的影響[J].中國(guó)油脂, 2000,25(6): 209-211

[8] 吳克剛,柴向華,楊連生。破囊壺菌(Thraustochytrium roseum)產(chǎn)DHA的營(yíng)養(yǎng)條件研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2003,29(2)42-47

[9]Bligh E G, Dyer W J1 A rapid method of totle lipid extraction and purication[J].Can J Biochem Phsiol,1959,37 :911-917

[10] L.Y. Zhu, M.H. Zong, H. Wu. Efficient lipid production with Trichosporon fermentans and its use for biodiesel preparation.[J].Bioresource Technology,2008, 99 :7881-7885

[11] 王永華 隱甲藻(Crythecodinium cohnii )高密度培養(yǎng)和油脂改性研究[D].廣州:華南理工大學(xué)博士學(xué)位論文,2002.5

[12] 蔡友華,范文霞,劉學(xué)銘等.響應(yīng)面法優(yōu)化巴西蟲草發(fā)酵培養(yǎng)基的研究[J]. 食用菌學(xué)報(bào)2007.14(2):55-59

[13]王菊芳. 隱甲藻(Crythecodinium cohnii )培養(yǎng)生產(chǎn)DHA的優(yōu)化及調(diào)控研究[D]. 廣州:華南理工大學(xué)博士學(xué)位論文,2000.5

[14] 洪楠，侯軍.SAS for Windows(V8)統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng)教程新編[M].北京：清華大學(xué)出版社,2004,1-189

---

---