當(dāng)前位置 > 首頁(yè) > 技術(shù)文章 > 生物標(biāo)志物研究與早期藥物研發(fā)基因表達(dá)分析功能學(xué)檢測(cè)RealTime ready 應(yīng)用

選型 | 市場(chǎng) | 應(yīng)用 | 使用 | 法規(guī) | 技術(shù) | 其他

生物標(biāo)志物研究與早期藥物研發(fā)基因表達(dá)分析功能學(xué)檢測(cè)RealTime ready 應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：6043　發(fā)布日期：2011-11-2　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

生物標(biāo)志物研究與早期藥物研發(fā)基因表達(dá)分析功能學(xué)檢測(cè)RealTime ready應(yīng)用

Sabine Lohmann*, Andrea Herold*, Tobias Bergauer#, Anton Belousov+, Gisela Betzl *, Manuel Dietrich*, Manuela Poignée-Heger *, David Geho’, Martin Weisser+

*Roche Applied Science, Penzberg, 德國(guó)
+Roche Pharma, Penzberg, 德國(guó)
#Roche Pharma, Basel, 瑞士
’Roche Pharma, Nutley, 美國(guó)

前言

生物標(biāo)志物與早期臨床藥物研發(fā)抗-TWEAK復(fù)合物研發(fā)舉例
TWEAK（腫瘤壞死因子樣細(xì)胞凋亡弱誘導(dǎo)因子）是一種多功能細(xì)胞因子，可控制包括細(xì)胞增殖、遷移、分化、凋亡、血管生成，以及炎癥在內(nèi)的多種細(xì)胞活動(dòng)。TWEAK通過(guò)與Fn14結(jié)合發(fā)揮作用，F(xiàn)n14 是一種具有高度誘導(dǎo)性的細(xì)胞表面受體，與包括細(xì)胞核因子- kB（NF-kB）途徑在內(nèi)的多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑具有相關(guān)性（2）。

Anti-TWEAK (RO5458640) 是一種直接針對(duì)TWEAK的重組人化 IgG1κ單克隆抗體。RO5458640 可與 TWEAK 結(jié)合，從而阻斷 TWEAK 與受體結(jié)合。Fn14：抑制TWEAK：Fn14 信號(hào)途徑與相應(yīng)下游作用可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng) (3)。

TWEAK 可與細(xì)胞外受體 Fn14 結(jié)合，通過(guò) NF-κB 途徑，
TWEAK與 Fn14 的結(jié)合可誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

根據(jù)文獻(xiàn)搜索與TWEAK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑生物學(xué)芯片數(shù)據(jù)，應(yīng)用“關(guān)鍵詞”搜索功能，于RealTime ready配置門(mén)戶(hù)網(wǎng)完成一個(gè)RealTime ready NF-kB定制型多孔檢測(cè)板的配置。為生成首個(gè)假設(shè)，使用RealTime ready NF-kB panel，于9種不同的腫瘤細(xì)胞系（經(jīng)過(guò)處理細(xì)胞系對(duì)未處理細(xì)胞系，于不同時(shí)間點(diǎn)，共使用 54 份樣本）中，進(jìn)行體外基因表達(dá)分析。根據(jù)細(xì)胞系結(jié)果，使用簡(jiǎn)化 NF-kB panel（35種參數(shù)），確認(rèn)體內(nèi)小鼠移植模型中的潛在生物標(biāo)志物�；诩�(xì)胞系與移植物測(cè)定結(jié)果，鑒定出13種潛在性、候選基因。為對(duì)假設(shè)進(jìn)行檢驗(yàn)，從上述參數(shù)中篩選出 6 種參數(shù)，進(jìn)行人FFPE樣本分析。上述6種參數(shù)與所選參考基因適合于感興趣的實(shí)體腫瘤（BC、CRC、NSCLC、肉瘤、RCC）。已經(jīng)開(kāi)發(fā)出RealTime ready qPCR檢測(cè)，并已經(jīng)進(jìn)行FFPET RNA分離功能的優(yōu)化。

個(gè)體化醫(yī)療（PHC）根據(jù)基因信息，針對(duì)個(gè)體的遺傳獨(dú)特性，對(duì)個(gè)體進(jìn)行衛(wèi)生保健、疾病預(yù)防與治療服務(wù)，滿(mǎn)足個(gè)體需要。對(duì)特定生物狀態(tài)指示劑的生物標(biāo)志物分子的識(shí)別與鑒定，在個(gè)體化醫(yī)療中具有重要作用（1）。因此，生物標(biāo)志物是藥物從靶點(diǎn)鑒定至藥物應(yīng)用生命周期的核心元素。前列腺素特異性抗原
（PSA）、c-反應(yīng)蛋白（CRP），與HER2/neu僅是眾多生物標(biāo)志物分子中的少數(shù)幾個(gè)。

生物標(biāo)志物研究中，人們對(duì)復(fù)雜生物背景下mRNA表達(dá)研究抱有濃厚興趣。RealTime ready RT-qPCR檢測(cè)與RealTime ready 配置門(mén)戶(hù)網(wǎng)站在線完成相關(guān)標(biāo)志物基因的選擇，qPCR功能檢測(cè)有助于了解基因表達(dá)概況。LightCycler®480多孔板上RealTime ready 定制型檢測(cè)多孔板上含有用戶(hù)選擇的、預(yù)置人、小鼠或大鼠靶序列qPCR檢測(cè)()。我們已經(jīng)建立起細(xì)胞系（體外）、移植小鼠模型（體內(nèi)），與各種人類(lèi)研究樣本FFPET切片生物標(biāo)志物研究的基因表達(dá)分析工作流。

生物標(biāo)志物研究RealTime ready qPCR檢測(cè)�？蓾M(mǎn)足不同檢測(cè)質(zhì)量要求。生物標(biāo)志物在治療性藥物復(fù)合物研發(fā)周期全程均非常重要（TWEAK復(fù)合物研發(fā)僅是一個(gè)例子。LightCycler® 480 real-time PCR 平臺(tái)聯(lián)合使用。

材料與方法

細(xì)胞培養(yǎng)
于標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行腫瘤細(xì)胞系（ACHN、Caki、SJSA、PANC-1、MDA-MB231、AsPC-1、SK-MES、NCI-H322M、22RV1）培養(yǎng)。使用TWEAK或 Anti-TWEAK（RO5458640）分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。于不同時(shí)間點(diǎn)收集腫瘤細(xì)胞系（0、6、24 小時(shí)），將RNA樣本存放（Qiagen）。

細(xì)胞 RNA 分離
使用MagNA Pure LC 儀、MagNA Pure LC RNA Kit –High Perfor-mance（Roche，貨號(hào)：03 542 394 001），與MagNA Pure LC 程序“RNA HP Cells”從細(xì)胞小球中分離總體細(xì)胞 RNA。溶解并混合細(xì)胞裂解物（1 x 106細(xì)胞每 600 µl RLT 緩沖液[Qiagen，貨號(hào)：79216]），并將 2 x 200 µl細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移至MagNA Pure Sample Cartridge wells（200 µl每孔）。洗脫裂解液重復(fù)分離制備的 RNA 至 50 µl，并收集洗脫液。FFPE 組織 RNA 分離使用 High Pure RNA Paraffin 試劑盒（Roche，貨號(hào)： 03 270 289 001），根據(jù)操作手冊(cè)（福爾馬林固定、石蠟包埋組織 RNA 分離方案），從10um FFPET 切片中分離總體細(xì)胞 RNA, 經(jīng)過(guò)調(diào)整的技術(shù)操作步驟如下：1 x 蛋白酶 K 85°C 消化 30 分鐘；第二次添加蛋白酶 K 55°C 消化 30 分鐘；室溫 High Pure 柱上DNase處理 15 分鐘。經(jīng)過(guò)調(diào)整的技術(shù)操作步驟更加快速、上機(jī)時(shí)間更短，顯示其性能具有可比性。

RNA 質(zhì)量控制
使用NanoDrop儀器進(jìn)行RNA制備物質(zhì)量與定量分析。使用Agilent生物分析儀與RNA Nano芯片進(jìn)行某些樣本RNA完整性分析。

cDNA合成
使用Transcriptor Universal cDNA Master（Roche，貨號(hào)：05 893 151 001）與 1ug 總體RNA進(jìn)行cDNA合成。每份樣本均建立3份獨(dú)立的40µl反應(yīng)液。逆轉(zhuǎn)錄系列RNA稀釋液，并分別進(jìn)行濃縮產(chǎn)物PCR。

實(shí)時(shí)qPCR
進(jìn)行 1g 總 RNA 3 份cDNA合成反應(yīng)混合液、稀釋處理，并將其作為模板，用于RealTime ready Custom Panel Plate, 384（Roche，貨號(hào)：05 582 873 001）。使用LightCycler® 480 Probes Master（Roche，貨號(hào)：04 707 494 001）進(jìn)行含有RNA的反應(yīng)混合物制備。
每孔總體PCR反應(yīng)容積是10 µl，終RNA容量是10ng。羅氏公司為每個(gè)儀器配備有LightCycler® 480 軟件，版本1.5，以及content.txt文件，從而使樣本設(shè)置與結(jié)果分析更加容易。

結(jié)果與討論

NF-kB RealTime ready Custom Panel體外細(xì)胞系研究篩選出35種差異表達(dá)基因。

為生成首個(gè)預(yù)測(cè)性與藥效學(xué)標(biāo)志物假設(shè)，我們使用一種多參數(shù)panel（92 種靶序列與 4 種看家基因），該panel涵蓋有 NF-kB途徑，以及廣泛的基因表達(dá)篩查方法。使用該panel是為建立高通量工作流程，并使操作更加方便。使用相關(guān)復(fù)合物處理過(guò)的腫瘤細(xì)胞系，進(jìn)行首個(gè)體外研究。以MagNA Pure LC 儀器自動(dòng) RNA 分離、具有RealTime ready NF-kB定制型多孔檢測(cè)板的、384-孔格式的LightCycler® 480 儀器 RT-qPCR與cDNA合成為起點(diǎn)，使工作流更加便利、快速，并進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)分析。

工作流描述：NF-κB RealTime ready 定制型多孔檢測(cè)板體外研究

靶基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化參考基因選擇
對(duì)于相關(guān)定量分析來(lái)說(shuō)，通過(guò)參考基因表達(dá)進(jìn)行靶基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化。理想情況下，標(biāo)準(zhǔn)化處理應(yīng)該能夠補(bǔ)償 RNA/cDNA起始量變異情況，以及cDNA合成或 PCR 擴(kuò)增中潛在抑制劑的作用。參考基因作為內(nèi)源性樣本材料對(duì)照，工作流中，與靶基因一同被處理。為獲取可靠結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)化中選擇合適的參考基因非常重要。合適參考基因即：在感興趣的樣本中，性能比較穩(wěn)定的、非表達(dá)調(diào)節(jié)基因（4，5）。如圖 1，于 4 個(gè)參考基因中選擇出 2 個(gè)基因作為參考基因。

圖 1：9 種細(xì)胞系 4 種參考基因表達(dá)分析。
本研究 9 種細(xì)胞系 4 種參考基因絕對(duì)Cq值（重復(fù)檢測(cè)）作圖。使用同樣cDNA混合液進(jìn)行PCR。分析
顯示，兩個(gè)參考基因模式相似，參考基因?yàn)椋篈LAS1 （氨基酮戊酸鹽、Δ-、合成酶 1）與 HPRT（次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 1）。第 3 個(gè)基因：MRPL19（線粒體核糖體蛋白 L19）性能非常具有可比性，第 4 個(gè)基因：G6PDH（葡萄糖-6-磷酸脫氫酶），具有獨(dú)特模式。因此，我們將 ALAS1 與 HPRT 作為參考基因，進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)分析。

差異基因表達(dá)結(jié)果
各種實(shí)體腫瘤 9 種細(xì)胞系 NF-kB panel與 RNA 基因表達(dá)分析中，通過(guò)Cq值標(biāo)準(zhǔn)化處理，以及聯(lián)合使用 2 個(gè)參考基因（RG），確認(rèn)出 35 個(gè)差異表達(dá)基因。Δ Cq計(jì)算如下：Cq_RG – Cq_靶值，Cq_RG是參考基因：ALAS 與 HPRT Cq均值。9 種細(xì)胞系 TWEAK 受體（Fn14）差異表達(dá)模式見(jiàn)圖 2

體內(nèi)移植片研究對(duì)RealTime ready NF-kB定制型多孔檢測(cè)板體外確認(rèn)的潛在藥效學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行確認(rèn)
應(yīng)用治療復(fù)合物后，藥效學(xué)生物標(biāo)志物（功能性生物標(biāo)志物）會(huì)發(fā)生改變，并顯示治療反應(yīng)（6）。確定治療復(fù)合物相關(guān)劑量非常重要。參數(shù)選擇后，使用體內(nèi)小鼠模型，對(duì)體外確定的假設(shè)生物標(biāo)志物進(jìn)行驗(yàn)證。使用移植物來(lái)源的新鮮凍存（FF）組織樣本對(duì)所選生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)。圖4顯示相關(guān)安慰劑對(duì)照的抗- TWEAK 處理移植物小鼠潛在藥效學(xué)生物標(biāo)志物相關(guān)基因表達(dá)比率。研究發(fā)現(xiàn)，用藥后，基因表達(dá)降低。

圖 2：9 種細(xì)胞系TWEAK受體基因表達(dá)。
相關(guān)比率（log 2 量表）計(jì)算如下：ΔCq = Cq_HK – Cq_Fn14。以細(xì)胞系與時(shí)
間點(diǎn)作圖。進(jìn)行 ALAS1 與 HPRT1 標(biāo)準(zhǔn)化處理。
ACHN：人腎細(xì)胞腺癌
Caki：人腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系
SJSA：人骨肉瘤；多源肉瘤
PANC-1：人胰腺癌；上皮樣細(xì)胞系
MDA-MB 231：人乳腺癌模型；乳房；乳腺；胸腔積液
AsPC-1：人胰腺腺癌
SK-MES-1: 人肺癌
NCI-H322M: 細(xì)支氣管肺泡腺癌
22RV1: 人前列腺癌移植片細(xì)胞系

通過(guò)RealTime ready NF-kB定制型多孔檢測(cè)板體外腫瘤細(xì)胞系與體內(nèi)移植物研究，可發(fā)現(xiàn)潛在反應(yīng)性預(yù)測(cè)標(biāo)志物。
反應(yīng)性預(yù)測(cè)（臨床反應(yīng)）生物標(biāo)志物可顯示：個(gè)體對(duì)治療性復(fù)合物是否會(huì)產(chǎn)生最佳反應(yīng)性（6）。著名事例：HER2/neu與Herceptin。
確認(rèn)潛在反應(yīng)性預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物，所選9種細(xì)胞系相關(guān)基因表達(dá)（參見(jiàn)圖 2）與小鼠模型移植腫瘤生長(zhǎng)抑制之間具有相關(guān)性。1或24小時(shí)收集的細(xì)胞系為未處理細(xì)胞系，使用抗-TWEAK進(jìn)行小鼠處理。細(xì)胞系基因表達(dá)結(jié)果表明，重現(xiàn)性非常高，處理時(shí)間或培養(yǎng)對(duì)表達(dá)結(jié)果無(wú)影響。小鼠模型腫瘤生長(zhǎng)抑制（TGI）與細(xì)胞系潛在生物標(biāo)志物相關(guān)基因表達(dá)之間相關(guān)性較高，見(jiàn)圖3。

圖 3：細(xì)胞系中反應(yīng)性預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物 1 基因表達(dá)與體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)抑制(TGI)結(jié)果之間相關(guān)性較高。
RealTime ready NF-κB 定制型多孔檢測(cè)板中基因表達(dá)結(jié)果與體內(nèi) TGI 作圖�！吧飿�(biāo)志物1”基因表達(dá)增加與 TGI 具有相關(guān)性。

圖 4：體內(nèi)小鼠移植片模型中，抗- TWEAK 治療反應(yīng)與潛在生物標(biāo)志物 2 相關(guān)基因表達(dá)比率作圖。log 2 量表（n = 5 只動(dòng)物）基因表達(dá)中值作圖。

FFPET 樣本特異性RealTime ready qPCR檢測(cè)潛在生物標(biāo)志物假設(shè)檢驗(yàn)
我們使用的第一套臨床樣本來(lái)自于各種用于人類(lèi)研究的福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）組織。腫瘤來(lái)源的 FFPE 組織是臨床試驗(yàn)或生物標(biāo)志物研究中，治療復(fù)合物研發(fā)最具有相關(guān)性的樣本材料。使用 High Pure RNA Paraffin 試劑盒，從 FFPE 組織（例如：10um切片）中提取RNA，修訂操作方案見(jiàn)“材料與方法”
章節(jié)的描述，其后是特異性?xún)?yōu)化與功能學(xué)檢測(cè)RealTime ready RT-qPCR分析。

由于福爾馬林固定，以及保存條件的原因，F(xiàn)FPET樣本分離RNA呈片段狀（7）。對(duì)于FFPET來(lái)源的RNA來(lái)說(shuō)，為提高靈敏性與重現(xiàn)性，使用長(zhǎng)度小于100bp的小片段擴(kuò)增子非常重要。RealTime ready 檢測(cè)專(zhuān)用于小片段擴(kuò)增子的擴(kuò)增。所有擴(kuò)增參數(shù)均應(yīng)是RNA特異性，無(wú)人類(lèi)基因組DNA污染。可通過(guò)引物探針設(shè)計(jì)來(lái)避免污染，引物探針序列可跨越外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)。假基因應(yīng)該是無(wú)法擴(kuò)增的，但并不是所有假基因均已知，或已被發(fā)表，必須在對(duì)照反應(yīng)中，使用人類(lèi)基因組DNA進(jìn)行假基因檢查。RealTime ready 專(zhuān)用于各種 FFPE 來(lái)源的，用于人類(lèi)研究的腫瘤樣本（例如：BC、CRC）的分離 RNA 檢測(cè)，并受到各種 FFPE 來(lái)源用于人類(lèi)研究的腫瘤樣本分離RNA檢測(cè)的檢驗(yàn)。根據(jù)以下參數(shù)，進(jìn)行最佳RealTime ready RT-qPCR檢測(cè)選擇：靈敏性、線性度、重現(xiàn)性與特異性。根據(jù)所感興趣組織中參數(shù)表達(dá)級(jí)別，cDNA合成所用特異性引物靈敏性應(yīng)該更高（參見(jiàn)圖 5）。

A) 生物標(biāo)志物 3/腎隨機(jī)引物

B) 生物標(biāo)志物 3/FFPET BC隨機(jī)引物

C) 生物標(biāo)志物 3/FFPET BC特異性引物

圖 5：潛在“生物標(biāo)志物 3”RealTime ready qRT-PCR 擴(kuò)增曲線。來(lái)自腎 RNA（A）與 FFPE 乳腺癌（BC）樣本（B 與 C）系列稀釋 RNA 模板。使用 250 ng，最低含量 0.4 ng 1：5 稀釋的 PCR 反應(yīng)混合物（A 與 B），或 100 ng，最低含量 0.16 ng 1：5 稀釋的 PCR 反應(yīng)混合物（C）進(jìn)行 PCR 啟動(dòng)。C中，使用特異性引物而不是隨機(jī)引物進(jìn)行cDNA合成啟動(dòng)，以提高靈敏性。

Cq值見(jiàn)表 1。

結(jié)論

使用體內(nèi)以及體外模型，假設(shè)生成生物標(biāo)志物研究中，以及人
FFPE研究樣本假設(shè)檢驗(yàn)中，可成功應(yīng)用RealTime ready RT-qPCR
檢測(cè)。已經(jīng)確立并對(duì)不同樣本工作流程方案進(jìn)行描述。使用
High Pure RNA Paraffin試劑盒，可從FFPE組織樣本中分離出RNA，
通過(guò)RealTime ready檢測(cè)，可進(jìn)行qRT-PCR分析。

參考文獻(xiàn)

1. NIH Biomarker Definitions Working Group,  Clin Pharmacol Ter 2001; 69: 89–95.
2. Winkles, J. A. (2008) Nature Reviews, Drug Discovery 7(5): 411–25.
3. RDR report # 1042689 (Draft vers. April 2011)
4. Bustin, S.A., et al. (2009) Clin Chem 55 (4): 611.
5. Vandesompele, J. et. al. (2002) Genome biology 3 (7)
6. de Koning, P. & Keirns, J. (2009) Biomarkers Med 3(6):  685–700.
7. Masuda, N., et al. (1999) Nucleic Acids Research 27 (22):  4436–43.

文章相關(guān)產(chǎn)品定購(gòu)信息

僅用于生命科學(xué)研究。不可用于臨床診斷。

LIGHTCYCLER、MAGNA PURE、HIGH PURE與REALTIME READY是羅氏公司注冊(cè)商標(biāo)。

來(lái)源：羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司
聯(lián)系電話：800-820-8864 400-820-8864
E-mail：china.lifescience@roche.com

【點(diǎn)擊可查看羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司相關(guān)產(chǎn)品】

標(biāo)簽：生物標(biāo)志物早期藥物研發(fā) 基因表達(dá)分析 RealTime ready

分享到：QQ空間新浪微博騰訊微博微信

【所有文章】【本類(lèi)新聞】【相關(guān)產(chǎn)品】【關(guān)閉窗口】

本類(lèi)文章

本類(lèi)新聞

A) 生物標(biāo)志物 3/腎隨機(jī)引物	B) 生物標(biāo)志物 3/FFPET BC隨機(jī)引物	C) 生物標(biāo)志物 3/FFPET BC特異性引物

圖 5：潛在“生物標(biāo)志物 3”RealTime ready qRT-PCR 擴(kuò)增曲線。來(lái)自腎 RNA（A）與 FFPE 乳腺癌（BC）樣本（B 與 C）系列稀釋 RNA 模板。使用 250 ng，最低含量 0.4 ng 1：5 稀釋的 PCR 反應(yīng)混合物（A 與 B），或 100 ng，最低含量 0.16 ng 1：5 稀釋的 PCR 反應(yīng)混合物（C）進(jìn)行 PCR 啟動(dòng)。C中，使用特異性引物而不是隨機(jī)引物進(jìn)行cDNA合成啟動(dòng)，以提高靈敏性。