半制備規(guī)模單鏈RNA純化

Sean M. McCarthy and Martin Gilar

Waters Corporation, Milford, MA, U.S.

寡核苷酸合成是非常高效和高產(chǎn)率的過(guò)程。在固相載體上進(jìn)行寡核苷酸反應(yīng)的典型產(chǎn)率為每耦合階98～99.5%。在典型的多階寡核苷酸合成中，雜質(zhì)聚集在一起，即使是一般大小的21基體寡核苷酸的總產(chǎn)率也達(dá)到67～90%，較長(zhǎng)鏈的寡核苷酸的產(chǎn)率相應(yīng)較低。研究人員通常需要使用純度高于初步合成混合物的材料。因此，用于基因敲除、基因分型和診斷目的寡核苷酸通常需要在合成后進(jìn)行純化。適合實(shí)驗(yàn)室規(guī)模寡核苷酸純化的經(jīng)濟(jì)可行的解決方案很少，而現(xiàn)有的方法（比如離子交換色譜分析法和聚丙烯酰胺凝膠電泳法）通常比較繁瑣和費(fèi)時(shí)。在本應(yīng)用說(shuō)明書(shū)中，我們介紹了一種成本低、速度快的中等數(shù)量材料的純化方法，單次進(jìn)樣載量高達(dá)140 nmoles，采用沃特世 ACQUITY UPLC^®系統(tǒng)和寡核苷酸分離技術(shù)（OST）色譜柱化學(xué)技術(shù)可達(dá)到95%以上的最終純度。所提出的純化規(guī)模與標(biāo)準(zhǔn)的寡核苷酸合成規(guī)模匹配良好（50至250 nmol）。下述方法可在15至30分鐘時(shí)間內(nèi)完成寡核苷酸純化，得到高純度產(chǎn)品。

 

RNA寡核苷酸5' -CCU UGU AAU CGC UUG ACG ATT -3'由供應(yīng)商處購(gòu)買(mǎi)，并在110 μL的0.1 M 醋酸三乙胺（TEAA)中進(jìn)行復(fù)溶，得到大約2.8nmol/ μL的溶液。為防止降解，樣品是在使用前不久制備的。

 

RNA寡核苷酸通過(guò)沃特世Alliance^® HPLC生物分離系統(tǒng)進(jìn)行純化，使用了沃特世 XBridge™ BEH OST C18 4.6 x 50mm的2.5 μm色譜柱，采用離子對(duì)反相色譜法進(jìn)行分離。¹

 

液相色譜系統(tǒng)：沃特世 Alliance HPLC生物分離系統(tǒng)

色譜柱： XBridge OST BEH C18 4.6 x 50mm, 2.5 μm

柱溫： 60 ˚C

流速： 1.0mL/min

流動(dòng)相A： 0.1M TEAA，pH 7.5

流動(dòng)相B： 80:20 0.1MTEAA/ACN

梯度： 30 – 52.5% B洗脫10.0分鐘(0.15% ACN／分鐘）

檢測(cè)： PDA，260nm

 

分離產(chǎn)物用沃特世 PDA檢測(cè)器在260nm處檢測(cè)。流動(dòng)相A由0.1% M醋酸三乙胺（TEAA）組成，流動(dòng)相B為80:200.1 MTEAA/乙腈。柱溫保持在 60℃。

 

如圖1中所示，盡管寡核苷酸合成的效率很高，在21-基體中仍存在許多失敗序列。

 

盡管色譜柱上超負(fù)荷加載了更大的質(zhì)量負(fù)荷，分離度仍保持N-1, N-2... 雜質(zhì)在主峰前洗脫。對(duì)21-基體寡核苷酸主峰從頂點(diǎn)開(kāi)始進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈睿�就�?huì)得到極高純度的產(chǎn)物。

 

圖2中所示被選中的餾份收集窗表示不同的質(zhì)量負(fù)荷。峰值采集后，樣品可以根據(jù)需要對(duì)等分和干燥，以便長(zhǎng)期儲(chǔ)存。TEAA的揮發(fā)性使離子對(duì)緩沖組分的去除非常容易。溶劑蒸發(fā)后被純化的寡核苷酸實(shí)際上是不含鹽的。

 

純化RNA寡核苷酸的純度通過(guò)ACQUITY UPLC系統(tǒng)來(lái)驗(yàn)證。如圖3所示，我們的純化方法有效地減少了失敗序列雜質(zhì)，所產(chǎn)生的寡核苷酸的純度比市面上可以買(mǎi)到的未經(jīng)純化的寡核苷酸高出許多。

 

液相色譜系統(tǒng)： 沃特世 ACQUITY UPLC系統(tǒng)

色譜柱： ACQUITY UPLC OST C18柱，

2.1 x 50mm，1.7 μm

柱溫： 60 ˚C

流速： 0.2 mL/min

流動(dòng)相A： 0.1M TEAA，pH 7.5

流動(dòng)相B： 80:20 0.1MTEAA/ACN

梯度： 35 – 85% B洗脫10.0分鐘

(1%ACN／分鐘）

檢測(cè)： PDA，260 nm

 

本文介紹的單鏈RNA寡核苷酸的純化策略速度快，成本低，可生成高純度材料。使用OST色譜柱化學(xué)技術(shù)和Alliance HPLC系統(tǒng)，大量的單鏈RNA粗產(chǎn)物可以在短時(shí)間內(nèi)成功純化，進(jìn)而得到高純度（約95%）的材料；根據(jù)所收集峰面積與樣品總峰面積的比值進(jìn)行估計(jì)，產(chǎn)率可達(dá)55%。

 

該方法對(duì)用于RNAi實(shí)驗(yàn)（這類(lèi)實(shí)驗(yàn)中保證純度和目標(biāo)的特異性至關(guān)重要）的單鏈RNA的純化極為有用。此外，由于T EAA的可揮發(fā)性，該策略可以將純化的寡核苷酸儲(chǔ)存，在沒(méi)有T EAA這種不必要的鹽的環(huán)境中，也可以避免其他純化手段中產(chǎn)生的不必要的雜質(zhì)。總的來(lái)說(shuō)，該策略提出了一個(gè)比目前可用方法更優(yōu)越的全面純化方法。此外，在考慮樣品純化所需的時(shí)間成本、反應(yīng)劑和沃特世XBridge OST色譜的壽命時(shí)，這種純化方法非常經(jīng)濟(jì)。

 

[1] 寡核苷酸的UPLC分離：方法開(kāi)發(fā)。沃特世應(yīng)用說(shuō)明書(shū)。2007: 720002383EN。

 

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