LaVision雙光子顯微鏡-無損傷無標記THG成像

Label-free live brain imaging and targeted patching with third-harmonic generation microscopy

Stefan Wittea,b,1, Adrian Negreana,b,c, Johannes C. Lodderb,c, Christiaan P. J. de Kockb,c, Guilherme Testa Silvab,c,

Huibert D. Mansvelderb,c,2, and Marie Louise Groota,b,2

aBiophysics Group, Institute for Lasers, Life, and Biophotonics Amsterdam, VU University, De Boelelaan 1081, 1081 HV, Amsterdam, The Netherlands;

cIntegrative Neurophysiology, Centre for Neurogenomics and Cognitive Research, VU University, De Boelelaan 1085, 1081 HV, Amsterdam, The

Netherlands; and bNeuroscience Campus Amsterdam, De Boelelaan 1085, 1081 HV, Amsterdam, The Netherlands

Edited* by Margaret M. Murnane, University of Colorado, Boulder, CO, and approved February 18, 2011 (received for review December 15, 2010)

 

摘要  在神經(jīng)科學和神經(jīng)外科中對活體大腦組織中神經(jīng)元的成像能力是一項基本要求。尤其是需求一種具有測微計尺分辨率的大腦形態(tài)學的非侵入探針的開發(fā)，因為它可以在臨床診斷上提供一種非侵入式光學活體組織檢查的手段。在這一領域，雙光子激光掃描顯微鏡(2PLSM)是一個強大工具，并已成為活體生物樣品最小侵入性損害的高分辨率成像的標準方法。但是，(2PLSM)基于光學方法提供足夠分辨率的同時，對熒光染料的需求妨礙了圖像對比度的提高。本文中，我們提供了一種活體大腦組織以細胞分辨率的高對比度成像方法，無需熒光探針，使用光學三次諧波發(fā)生進行成像。我們利用細胞水平的特殊幾何學和大腦組織的液體內容物來獲取THG的部分相匹配，提供了一種熒光對比度機制的替代方法。我們發(fā)現(xiàn)THG大腦圖像允許快速、無侵入性標記的神經(jīng)元、白質結構、血管同時成像。而且，我們利用THG成像來引導微吸管指向活體組織中指定的神經(jīng)元。這個工作是一個無標記活體大腦成像的主要步驟，并開啟了活體大腦中激光引導的微注射技術發(fā)展的可能性。

 

THG成像

    對于THG成像實驗，我們使用了一臺商業(yè)化雙光子激光掃描顯微鏡(TrimScope, Lavision BioTec GmbH)。光源是一個光學參量震蕩器（Mira-OPO，APE），810nm泵浦光來自一個Ti：Sa鎖模激光器(Coherent Chameleon Ultra II)。使用一個20X，0.95N.A水浸物鏡(Olympus XLUMPFL-IR)將光聚焦到樣品上。使用epidetection幾何學描述THG實驗。使用分光鏡(Chroma T800lpxrxt)將背景散射THG光子從入射激光束中分離出來，用一個THG波段的帶通濾波器(Chroma HQ390-70X)過濾。檢測器是GaAsP高靈敏度光電倍增管(Hamamatsu H7422-40)，400nm處量子效率為25%。最高分辨率成像(1024×1024像素)的典型獲取時間為1.6s，我們用于目標定向實驗的512 X 512像素成像時間為0.6s。 為與前向端口比較，使用了一個定制的投射端口。這個端口使用了一個1.4N.A油浸物鏡，一個長波分光鏡（UQG optics)和一個400nm的相干窄帶濾波器。對于THG與SR-101聯(lián)合實驗我們用1200nm的OPO來同時產(chǎn)生兩種信號。使用一個594nm帶通和561nm隔斷的分光鏡將SR-101熒光從THG信號中分離。SR-101信號使用一個PMT檢測(Hamamatsu H6780-20)。Nile Red和THG成像也是由1200nm的OPO同步激發(fā)。在這個案例中THG信號由投射端口測量，Nile Red熒光通過一個593∕40 nm的帶寬濾波器檢測。對于THG和GFP聯(lián)合成像，用來泵浦OPO的Ti：Sa激光被調諧到970nm并耦合到顯微鏡中。組織塊的GFP和THG信號使用同一個檢測器連續(xù)測量。但使用一個不同的(561∕40 nm)帶通濾波器檢測GFP。使用顯微鏡軟件(Imspector Pro)獲取圖像并以16bit 的tiff格式存儲，圖像分析使用Image J(MacBioPhotonics)進行。

 

Fig. 1.無標記活體大腦的三次諧波顯微成像(A)腦組織THG成像的epidetection幾何學圖示。插圖：THG原理。注意基質中沒有光學激發(fā)發(fā)生。(B) 樹突處的聚焦激光束。通過將激光聚焦體積設定到樹突直徑的幾倍大小，可以獲得部分相匹配，顯著的THG信號將會產(chǎn)生。(C)細胞體內的聚焦激光束。由于不好的結構相匹配狀態(tài)，沒有THG信號產(chǎn)生。(D) 小鼠大腦組織的活神經(jīng)元成像。體細胞以暗影存在。

Fig. 2.活體大腦組織的THG成像

(A)小鼠皮質的THG圖像 (B) 與A同位置的Nile Red染色的雙光子熒光圖像 (C) 大鼠凹陷的腦回THG圖像（水平切面） (D)小鼠腦胼胝體THG圖像，軸突纖維束被清晰得分辨。Movie S1是這個結構的一個3D投影 (E)小鼠大腦紋狀體的THG圖像（冠狀面）。白質和神經(jīng)元細胞清晰可見。明亮的粒狀結構是垂直穿行圖像平面的軸突纖維。Movie S2是這個區(qū)域的3D投影。 (F)麻醉活小鼠的腦皮質上層的血管THG圖像（z棧平均投影密度是50um）

Fig. 3. THG與雙光子成像的疊加

 (A)小鼠額前葉腦皮質的THG圖像 (B)SR-101標記的星細胞雙光子圖像 (C) A、B的疊加提供了神經(jīng)網(wǎng)絡中星細胞的分布信息 (D) 小鼠額前葉皮質的THG圖像 (E) GFP標記的生長抑素神經(jīng)元的雙光子熒光圖像 (F)D、E的疊加顯示了生長抑素神經(jīng)元在腦前葉皮質結構中的分布

Fig. 4.THG成像深度與自動化細胞檢測 (A–C) 小鼠額前葉皮質的THG圖像，成像深度分別為100, 200, and 300 μm 。每幅圖像都是3個以2微米深度間隔獨立圖像的最大密度投影(D) 110 μm深度處神經(jīng)元細胞的自動檢測THG圖像。細胞檢測的運算法則定義為以紅色顯示的神經(jīng)元 (E)紅色標記：來自A-C的圖像棧的細胞可見性對比。黑色標記：作為一個深度功能的平均檢測到的THG密度。

Fig. 5. 無標記目標定向和細胞活性

(A)小鼠新大腦皮層的THG圖像 (B) 在對一個神經(jīng)元進行THG引導膜片鉗之后同一位置的THG圖像 (C)一個200um深處鉗住神經(jīng)元的大視野THG圖像（5幅深度間隔2um的圖像平均） (D)記錄以100pA電流脈沖刺激B中被鉗住的神經(jīng)元的動力勢訓練 (E) 測量在THG掃描期間靜止膜電位的改變。即使以最高的能量，也只觀察到4%的電壓變化，保持了完全的可逆性。0.8秒的周期相應于圖像掃描時間。(F)最大觀察到的靜止膜電位Vs掃描時的激光能量。沒有非線性效應出現(xiàn)。