活體動物體內(nèi)生物發(fā)光和熒光成像技術(shù)基礎(chǔ)原理與應(yīng)用簡介

活體動物體內(nèi)成像技術(shù)是指應(yīng)用影像學(xué)方法，對活體狀態(tài)下的生物過程進行組織、細胞和分子水平的定性和定量研究的技術(shù)�；铙w動物體內(nèi)成像技術(shù)主要分為可見光成像 (optical imaging)、核素成像（radio-nuclear imaging）、核磁共振（magnetic resonance imaging ，MRI）成像和超聲（ultrasound）成像、計算機斷層攝影（computed tomography ，CT）成像五大類，其中可見光成像和核素成像特別適合研究分子、代謝和生理學(xué)事件，通常稱為功能成像；超聲成像和CT則適合于解剖學(xué)成像，通常稱為結(jié)構(gòu)成像。功能成像與結(jié)構(gòu)成像比較，前者更能夠反映細胞或基因表達的空間和時間分布，從而了解活體動物體內(nèi)的相關(guān)生物學(xué)過程、特異性基因功能和相互作用。所以，活體動物體內(nèi)功能成像技術(shù)可用于觀察和追蹤靶細胞、基因的表達，同時檢測多種分子事件，優(yōu)化藥物和基因治療方案，從分子和細胞水平對藥物療效進行觀察，從整體動物水平上評估疾病發(fā)展過程，對同一個動物進行時間、環(huán)境、發(fā)展和治療影響跟蹤。由于功能成像的諸多優(yōu)勢，這項技術(shù)廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開發(fā)等方面，本文重點介紹活體動物可見光成像技術(shù)。

 

體內(nèi)可見光成像(optical in vivo imaging)技術(shù)主要包括生物發(fā)光(bioluminescence)與熒光(fluorescence)成像兩種技術(shù)。生物發(fā)光成像是用熒光素酶(luciferase)基因標記細胞或DNA，利用其產(chǎn)生的蛋白酶與相應(yīng)底物發(fā)生生化反應(yīng)產(chǎn)生生物體內(nèi)的探針光信號；而熒光成像則是采用熒光報告基因（如GFP、RFP）或Cyt及dyes等熒光染料進行標記，利用熒光蛋白或染料產(chǎn)生的熒光就可以形成體內(nèi)的熒光光源。前者是動物體內(nèi)的自發(fā)光，不需要激發(fā)光源，可通過高度靈敏的CCD直接捕捉光信號，而后者則需要外界激發(fā)光源的激發(fā)才可以捕捉發(fā)光信號。傳統(tǒng)的動物實驗方法需要在不同的時間點宰殺實驗動物以獲得數(shù)據(jù), 得到多個時間點的實驗結(jié)果。相比之下，體內(nèi)可見光成像技術(shù)通過對同一組實驗對象在不同時間點進行記錄，跟蹤同一觀察目標（標記細胞及基因）的移動及變化，所得的數(shù)據(jù)也更加真實可信。另外, 這一技術(shù)由于不涉及放射性物質(zhì)，具有操作簡單，所得結(jié)果直觀，靈敏度高等特點, 在剛剛發(fā)展起來的幾年時間內(nèi)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開發(fā)等方面。

 

 

1. 標記原理

哺乳動物生物發(fā)光，一般是將Firefly luciferase基因（由554個氨基酸構(gòu)成，約50KD）即熒光素酶基因整合到預(yù)期觀察的細胞染色體DNA上以表達熒光素酶，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達熒光素酶的細胞株，當(dāng)細胞分裂、轉(zhuǎn)移、分化時, 熒光素酶也會得到持續(xù)穩(wěn)定的表達。基因、細胞和活體動物都可被熒光素酶基因標記。將標記好的細胞接種到實驗動物體內(nèi)后，當(dāng)外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素(luciferin)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP，氧存在的條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，因此只有在活細胞內(nèi)才會產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且發(fā)光光強度與標記細胞的數(shù)目線性相關(guān)。

 

除Firefly Luciferase外，有時也會用到Renilla Luciferase。二者的底物不一樣，前者的底物是熒光素（D-luciferin），后者的底物是coelentarizine。二者的發(fā)光波長不一樣，前者所發(fā)的光波長在540~600nm，后者所發(fā)的光波長在460~540nm左右。前者所發(fā)的光更容易透過組織，后者在體內(nèi)的代謝比前者快，而且特異性沒有前者好，所以大部分活體實驗使用Firefly Luciferase作為報告基因，如果需要雙標記，也可采用后者作為備選方案。

 

熒光素酶的發(fā)光是生物發(fā)光，不需要激發(fā)光，但需要底物熒光素。熒光素在氧氣、ATP存在的條件下和熒光素酶發(fā)生反應(yīng)，生成氧化熒光素(oxyluciferin)，并產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。

 

對于細菌標記，一般利用發(fā)光酶基因操縱子luxABCDE或luxCDABE，其由控制的編碼熒光素酶的基因和編碼熒光素酶底物合成酶的基因組成。利用這種辦法進行標記的細菌會持續(xù)發(fā)光，不需要外源性底物。但是一般細菌標記需要轉(zhuǎn)座子的幫助把外源基因插入到細菌染色體內(nèi)穩(wěn)定表達。

 

2. 底物熒光素的特點

熒光素由于諸多優(yōu)點得到廣大科研人員的青睞，主要特點如下：

(1) 熒光素不會影響動物的正常生理功能。

(2)熒光素是280道爾頓的小分子，水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透細胞膜和血腦屏障。

(3) 熒光素在體內(nèi)擴散速度快，可通過腹腔注射或尾部靜脈注射進入動物體內(nèi)。腹腔注射擴散較慢，持續(xù)發(fā)光長。熒光素腹腔注射老鼠后約1min后表達熒光素酶的細胞開始發(fā)光，10min后強度達到穩(wěn)定的最高點，在最高點持續(xù)約20~30 min后開始衰減，約3h后熒光素排除，發(fā)光全部消失，最佳檢測時間是在注射后15~35min之間；若進行熒光素靜脈注射，擴散快，但發(fā)光持續(xù)時間很短�？蒲腥藛T根據(jù)大量的實驗總結(jié)出熒光素的合適的用量是150mg/kg，即體重20克的小鼠需要3毫克的熒光素。

(4) 觀察時間的間隔沒有最短限制，只要觀察的條件控制一致就可以。雖然底物在動物體內(nèi)有一定的代謝過程，但是上一次底物的殘留曲線可以知道，可以控制對下一次觀察結(jié)果的影響。

 

3. 光學(xué)原理

光在哺乳動物組織內(nèi)傳播時會被散射和吸收，光子遇到細胞膜和細胞質(zhì)時會發(fā)生折射現(xiàn)象，而且不同類型的細胞和組織吸收光子的特性并不一樣。血紅蛋白（hemoglobin）是造成體內(nèi)可見光被吸收的主要因素，其吸收可見光中藍綠光波段的大部分。但是在可見光大于600納米的紅光波段，血紅蛋白的吸收作用卻很小。因此，在偏紅光區(qū)域, 大量的光可以穿過組織和皮膚而被檢測到。利用活體動物生物發(fā)光成像技術(shù)最少可以檢測到皮下的幾百個細胞。當(dāng)然，由于發(fā)光源在老鼠體內(nèi)深度的不同可看到的最少細胞數(shù)是不同的。一般認為，每一厘米深度，發(fā)光強度衰減10倍，血液豐富的組織或器官（比如心臟、肝臟、肺臟）衰減多，與骨骼相鄰的組織或器官衰減少。在相同的深度情況下，檢測到的發(fā)光強度和細胞的數(shù)量具有非常好的線性關(guān)系，可由儀器量化檢測到的光強度，反映出細胞的數(shù)量。

 

活體生物發(fā)光成像技術(shù)是一項在某些領(lǐng)域有不可替代優(yōu)勢的技術(shù)，比如腫瘤轉(zhuǎn)移研究、藥物開發(fā)、基因治療、干細胞示蹤等方面。

1．腫瘤學(xué)

活體生物發(fā)光成像技術(shù)能夠讓研究人員能夠直接快速的測量各種癌癥模型中腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移以及對藥物的反應(yīng)。其特點是極高的靈敏度使微小的腫瘤病灶（少到幾百個細胞）也可以被檢測到，比傳統(tǒng)方法的靈敏度大大提高了；非常適合于腫瘤體內(nèi)生長的定量分析；避免由于宰殺老鼠而造成的組間差異；節(jié)省動物成本。由于以上特點，使基于轉(zhuǎn)移模型、原位模型、自發(fā)腫瘤模型等方面的腫瘤學(xué)研究得到發(fā)展。建立腫瘤轉(zhuǎn)移模型，可以觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況，進一步探討腫瘤轉(zhuǎn)移的機制；可進行原位接種，觀察原位以及原位轉(zhuǎn)移模型，使腫瘤學(xué)研究更接近腫瘤臨床發(fā)病的微觀環(huán)境；通過建立自發(fā)腫瘤模型，可以觀察腫瘤發(fā)生機理。（圖11-1）。

 

圖11-1 腫瘤的長期檢測，左圖分別是7天，14天，30天成像。來自中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院

 

2．藥物研究

在藥效學(xué)評價方面，熒光素酶癌癥模型可用于癌癥體內(nèi)用藥在整體動物水平上進行長期療效跟蹤觀察。利用無創(chuàng)傷活體成像對癌細胞生長的檢測，可對癌癥治療之前和過程中的癌細胞的變化進行實時觀測和評估。這種方式提供一個很好的對癌細胞的反應(yīng)和復(fù)發(fā)評估的預(yù)診斷途徑。用活體成像的方法比傳統(tǒng)技術(shù)有更高的靈敏度，當(dāng)用傳統(tǒng)的方法還不能檢測到瘤塊時，用該技術(shù)已經(jīng)可以檢測到很強的信號。由于該技術(shù)只是檢測活細胞，不能檢測已經(jīng)凋亡的細胞。而用傳統(tǒng)的方法，不能區(qū)別正常細胞與凋亡的細胞，所以該技術(shù)可以比傳統(tǒng)技術(shù)更早更靈敏的發(fā)現(xiàn)藥物的療效。

 

利用活體成像技術(shù)高靈敏度、觀察方便的特點，在抗腫瘤藥物臨床前研究中，通過給予腫瘤接種的小鼠不同劑量，不同給藥時間、不同給藥途徑，觀察抗腫瘤藥物的最佳給藥途徑、給藥劑量及給藥時間，從而制定合適的劑型與服藥時間。

 

在藥物代謝方面，標記與藥物代謝有關(guān)的基因，比如CYP3A4等，研究不同的藥物對該基因表達的影響，從而可以間接知道相關(guān)藥物在體內(nèi)代謝的情況。

 

在藥劑學(xué)研究方面，可以通過把熒光素酶報告基因的質(zhì)粒直接裝載在藥物載體中，觀察藥物載體的靶向臟器與體內(nèi)分布規(guī)律（圖11-2）。在藥理學(xué)方面，還可以通過轉(zhuǎn)基因小鼠的應(yīng)用，觀察藥物作用的通路，用熒光素酶基因標記某一個興趣基因，觀察藥物作用的通路。

 

圖11-2利用IL-1Β轉(zhuǎn)基因小鼠篩選抗炎癥藥物，來自上海南方模式生物研究中心

 

3．基因治療

基因治療是將正常基因或有治療作用的基因通過一定方式導(dǎo)入靶細胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達到治療疾病目的。目前，基因治療主要是以病毒做載體，可應(yīng)用熒光素酶基因作為報告基因加入載體，觀察目的基因是否到達動物體內(nèi)的特異組織和是否持續(xù)高效表達，這種非侵入方式具有低毒性及免疫反應(yīng)輕微等優(yōu)點且可以直接實時觀察，了解病毒或載體侵染的部位和時域信息；熒光素酶基因也可以插入脂質(zhì)體包裹的DNA分子中，用來觀察脂質(zhì)體為載體的DNA運輸和基因治療情況；也可以表達熒光素酶基因的質(zhì)粒裸DNA為模型DNA，直接注入動物體內(nèi)，利用生物發(fā)光成像可以分析不同載體、不同注射位點、不同注射量對熒光素酶基因表達的影響，同時也可以時空量化分析基因表達的分布、水平和持續(xù)時間。這種可視的方法直觀地評價DNA的轉(zhuǎn)染效率和表達效率，在基因治療研究中具有重要的指導(dǎo)作用。

 

4．干細胞及免疫學(xué)

用熒光素酶標記干細胞有以下幾種方法：一種是標記組成性表達的基因，做成轉(zhuǎn)基因動物，干細胞就被標記了，若干細胞移植到另外動物體內(nèi)，可以用活體生物發(fā)光成像技術(shù)示蹤干細胞在體內(nèi)的增殖、分化及遷徙的過程；另外一種方法是用慢病毒直接標記干細胞后，移植到體內(nèi)觀測其增殖、分化及遷徙過程，研究其修復(fù)、治療損傷或缺陷部分的效果，進一步探討其機制。

 

可以通過標記免疫細胞，觀察免疫細胞對腫瘤細胞等的識別和殺死功能，評價免疫細胞的免疫特異性、增殖、遷移及功能等；通過標記異體細胞，觀察異體細胞對器官移植影響；也可進行一些關(guān)于免疫因子的研究等。

 

5．基因表達模式與基因功能研究

研究基因表達可以從影響基因表達的各個不同的層面進行相關(guān)的研究，如利用融合蛋白（p27-luc融合蛋白研究其在Cdk細胞分裂周期的表達），興趣基因啟動子控制的熒光素酶（Catenin在腫瘤轉(zhuǎn)移的信號傳導(dǎo)機制），siRNA方式和轉(zhuǎn)基因動物等方法。

 

為研究目的基因是在何時、何種刺激下表達，將熒光素酶基因插入目的基因啟動子的下游，并穩(wěn)定整合于實驗動物染色體中，形成轉(zhuǎn)基因動物模型。通過這種方法實現(xiàn)熒光素酶和目的基因的平行表達，從而可以直接觀察目的基因的表達模式，包括數(shù)量、時間、部位及影響其表達和功能的因素等；也可用于研究動物發(fā)育過程中特定基因的時空表達情況，觀察藥物誘導(dǎo)特定基因表達；以及其它生物學(xué)事件引起的相應(yīng)基因表達或關(guān)閉。

 

6．蛋白質(zhì)相互作用

可利用動物體內(nèi)生物發(fā)光成像技術(shù)研究活體動物體內(nèi)蛋白與蛋白的相互作用。其原理是將分開時都不單獨發(fā)光的熒光酶的C端和N端分別連接在兩個不同的蛋白質(zhì)上，若是這兩個蛋白質(zhì)之間有相互作用，熒光酶的C端和N端就會被連接到一起，激活熒光素酶的轉(zhuǎn)錄表達，在有底物存在時出現(xiàn)生物發(fā)光。在活體條件下研究藥物對蛋白質(zhì)相互作用的影響，可以觀察到在體外實驗中無法模擬的活體環(huán)境對蛋白質(zhì)相互作用的影響。

 

7．細胞凋亡

利用活體動物生物發(fā)光成像技術(shù)，直接觀察活體動物體內(nèi)的細胞凋亡。具體原理是用分子生物學(xué)方法在熒光酶的兩端連接上抑制其發(fā)光的蛋白(如雌激素)，但在其連接處加上caspase (細胞凋亡時特異表達的一種酶)的酶切點。細胞發(fā)生凋亡時，表達caspase，切開抑制熒光酶發(fā)光的蛋白，使熒光素酶開始發(fā)光。

 

8. 疾病機理

可以標記與某種疾病密切相關(guān)的基因，做成轉(zhuǎn)基因小鼠，通過特定的藥物作用或其他條件下該基因表達的變化，來推測該疾病的發(fā)病機理和藥物對疾病治療的效果等。

 

9．其他

如RNAi、蛋白質(zhì)核運輸?shù)�。在熒光素酶基因的一端接要研究的蛋白質(zhì)的基因，另一端接肯定在細胞核內(nèi)表達的蛋白的基因，當(dāng)核外的蛋白運輸?shù)胶藘?nèi)時，就會導(dǎo)致熒光素酶N端、C端靠近，恢復(fù)發(fā)光。

 

 

1．標記原理

活體熒光成像技術(shù)主要有三種標記方法。

（1）熒光蛋白標記：熒光蛋白適用于標記細胞、病毒、基因等，通常使用的是GFP、EGFP、RFP（DsRed）等；

（2）熒光染料標記：熒光染料標記和體外標記方法相同，常用的有Cy3、Cy5、Cy5.5及Cy7，可以標記抗體、多肽、小分子藥物等；

（3）量子點標記：量子點（quantum dot)是一種能發(fā)射熒光的半導(dǎo)體納米微晶體，是由數(shù)百到數(shù)萬個原子組成的原子簇，尺寸在100nm以下，外觀恰似一極小的點狀物。量子點作為一類新型的熒光標記材料，其在長時間生命活動監(jiān)測及活體示蹤方面具有獨特的應(yīng)用優(yōu)勢。與傳統(tǒng)的有機熒光試劑相比較，量子點熒光比有機熒光染料的發(fā)射光強的20倍，穩(wěn)定性強100倍以上，具有熒光發(fā)光光譜較窄、量子產(chǎn)率高、不易漂白、激發(fā)光譜寬、顏色可調(diào)，并且光化學(xué)穩(wěn)定性高，不易分解等諸多優(yōu)點。主要應(yīng)用在活細胞實時動態(tài)熒光觀察與成像，可以在長達數(shù)天內(nèi)進行細胞的分化和世系觀察, 以及細胞間、細胞內(nèi)及細胞器間的各種相互作用的原位實時動態(tài)示蹤。不但如此，量子點還可以標記在其他需要研究的物質(zhì)上，如藥物、特定的生物分子等，示蹤其活動及作用。

 

2．光學(xué)原理

熒光發(fā)光是通過激發(fā)光激發(fā)熒光基團到達高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生發(fā)射光。同生物發(fā)光在動物體內(nèi)的穿透性相似，紅光的穿透性在小動物體內(nèi)比藍綠光的穿透性要好得多，隨著發(fā)光信號在體內(nèi)深度的增加，波長越接近900nm的光線穿透能力越強，同時可消減背景噪音的干擾，近紅外熒光為觀測生理指標的最佳選擇。在實驗條件允許的條件下，應(yīng)盡量選擇發(fā)射波長較長的熒光蛋白或染料。

 

1．腫瘤學(xué)

活體熒光成像技術(shù)能夠無創(chuàng)傷定量檢測小鼠的皮下瘤模型。相對于生物發(fā)光成像技術(shù)，活體熒光成像技術(shù)檢測時間較快，只需要不到1s的時間，同時不需要注射底物，節(jié)約了檢測成本。但是需要選擇近紅外熒光檢測深部組織，目前此波段的熒光蛋白種類有限，精確定量較難。

（1）GFP標記的肺腫瘤模型（H-460-GFP）

H-460-GFP是一個綠色熒光蛋白表達細胞系，它起源于H-460肺小細胞肺癌，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了綠色熒光蛋白基因，并由SV-40啟動子起始基因的表達。

通過H-460-GFP皮下腫瘤模型，建立小鼠肺癌的實驗?zāi)Ｐ停�可用來進行有關(guān)抗癌藥物的篩選（圖11-3）。可用于測量皮下腫瘤的生長和監(jiān)測對潛在化學(xué)治療藥物的反應(yīng)。

   

圖11-3  左圖是接種后1w熒光成像，右圖是3w熒光成像（上海市腫瘤研究所供圖）

 

（2）量子點標記細胞系

通過量子點可以標記腫瘤細胞，用量子點Qtracker® 705對MDA-MB-231乳腺癌細胞進行標記，皮下接種后動態(tài)觀察其生長以及變化（圖11-4）。激發(fā)光波長625nm ，散射光波長680nm。

 

圖11-4 量子點標記腫瘤細胞不同時間熒光成像

 

2．抗體

分子探針的一端聯(lián)有能夠和生物體內(nèi)特異靶點結(jié)合的分子結(jié)構(gòu)（如肽類、酶的底物、配體等），另一端則是熒光染料。通過Cy5.5標記的抗體的體內(nèi)代謝實驗，可見肝、腎等處的分布（圖11-5）。

   

 

圖11-5   Cy5.5標記的抗體的體內(nèi)代謝實驗（上海市腫瘤研究所供圖）

 

3． 藥學(xué)研究

熒光成像在藥物制劑學(xué)研究，尤其是藥物靶向性研究，藥物載體研究中有巨大優(yōu)勢。有關(guān)專家正在設(shè)計用合適的熒光染料標記小分子藥物，觀察藥物在動物體內(nèi)的特異性分布和代謝情況，尤其是中藥研究方面。

 

應(yīng)用透射儀從樣本底部激發(fā)光源，可以提高活體熒光成像的靈敏度和檢測的深度。圖11-6是應(yīng)用NIR熒光染料標記的β淀粉酶來觀察治療Alzheimer病的藥物的治療效果，曝光時間僅為200 ms，激發(fā)波長680nm，散射光波長720nm。

 

圖11-6  NIR標記的β淀粉酶成像

 

4．組織工程

通過發(fā)展EGFP基因表達的細胞系無創(chuàng)傷的評價組織工程的構(gòu)建。通過EGFP標記的組織工程細胞移植到小鼠體內(nèi)特制的支架上，觀察該細胞的生長和變化，從而判斷組織工程的成敗與否。

 

	優(yōu)     點	缺    點
生物發(fā)光	特異性強，無自發(fā)熒光 高靈敏度，在體內(nèi)可檢測到幾百個細胞 檢測的深度在3-4厘米 精確定量	信號較弱，檢測時間較長，需要靈敏的CCD鏡頭，儀器精密度要求高； 需要注入熒光素，實驗成本高； 細胞或基因需要轉(zhuǎn)基因標記； 有些物質(zhì)不能用生物發(fā)光標記，如抗體、多肽等 很難用于人體。
熒光	熒光染料、蛋白標記能力強，多種蛋白及染料可用于多重標記； 信號強度大，成像速度快； 實驗成本低； 活體動物、動物尸體、器官全部可以進行成像； 可銜接體內(nèi)實驗和體外實驗，保持研究的連貫性； 未來可能用于人體。	非特異性熒光限制了靈敏度，體內(nèi)檢測最低約105細胞； 檢測深度受限制； 較難精確體內(nèi)定量。