淀粉蛋白腦室內(nèi)注射建立阿爾茨海默病大鼠模型

淀粉蛋白腦室內(nèi)注射建立阿爾茨海默病大鼠模型

【摘要】　目的　觀察β淀粉樣蛋白(Aβ) 腦室內(nèi)注射建立阿爾茨海默病(AD) 大鼠模型及其對(duì)大鼠行為、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活性、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF) 水平等影響。方法　將Aβ1242 注射入大鼠側(cè)腦室,于第1 周、2 周、4 周觀察Morris 水迷宮逃避潛伏期、測(cè)定腦內(nèi)ChAT 活性、進(jìn)行原位末端標(biāo)記凋亡染色及NGF 免疫組化染色。結(jié)果　Aβ1242 注射后第2 周大鼠Morris 水迷宮逃避潛伏期延長(zhǎng),4 周時(shí)更明顯。2 周后海馬、皮層ChAT 活性下降,4 周后腦內(nèi)ChAT 活性廣泛下降,以海馬最為顯著。2 周后基底前腦Meynert核區(qū)凋亡細(xì)胞較其他腦區(qū)增多,NGF 陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少。結(jié)論　Aβ腦室內(nèi)注射可以模擬AD 行為改變,使腦內(nèi)ChAT 活性降低,基底前腦NGF 含量減少,膽堿能神經(jīng)元凋亡,可以作為AD 研究模型。

【關(guān)鍵詞】　阿爾茨海默病　β淀粉樣蛋白　膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶　神經(jīng)生長(zhǎng)因子

 

　【中圖分類號(hào)】　R749. 1 　　　　　　　【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】　A

　　阿爾茨海默病(Alzheimer Disease , AD) 發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是β淀粉樣蛋白(β2amyloid protein ,Aβ) 在腦中的沉積[1 ] ,多種神經(jīng)元尤其是膽堿能神經(jīng)元原發(fā)性變性,腦內(nèi)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(cholineacetyl transferase ,ChAT) 活性下降,是AD 的標(biāo)志性生化改變[2 ] 。AD 等神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病與細(xì)胞凋亡的發(fā)生密切相關(guān)[3 ] ,而神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor ,NGF) 是中樞膽堿能系統(tǒng)重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,具有明顯的抗凋亡作用[4 ] 。

 

AD 基礎(chǔ)研究和藥物開發(fā)的最大障礙是缺乏一種與AD 病理、生化、和行為等改變相似的理想動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)通過Aβ腦室內(nèi)注射建立AD 大鼠模型,觀察大鼠行為學(xué)改變、腦內(nèi)各部位ChAT 活性變化、神經(jīng)元凋亡情況,以及NGF 水平改變,為進(jìn)一步的AD 治療研究提供動(dòng)物模型。

111 　動(dòng)物分組及Aβ腦室內(nèi)注射　雄性Wistar 大鼠48 只,體重260～300 g ,隨機(jī)分為4 組:對(duì)照組、Αβ注射后7 天組、14 天組、28 天組,每組12 只。大鼠麻醉后用微量注射器緩慢將藥物注入右側(cè)腦室(前囪后018 mm ,中線旁開111 mm ,深度316 mm) 。Aβ模型組注射Aβ1242 (購(gòu)自美國(guó)AnaSpec 公司) ,每次7 μg ,連續(xù)3天,對(duì)照組注射生理鹽水,每次7μL ,連續(xù)3 天。

112 　Morris 水迷宮試驗(yàn)　參照文獻(xiàn)方法[5 ] ,記錄大鼠找到平臺(tái)所需逃避潛伏期。各實(shí)驗(yàn)組分別于最后1 次藥物注射后第5～7d ,12～14 d ,26～28 d 進(jìn)行試驗(yàn),對(duì)照組同時(shí)試驗(yàn)。

113 　取材　Aβ注射組分別于最后1 次藥物注射后第7 天、14天、28 天宰殺取材,對(duì)照組于最后1 次藥物注射后28 天取材。每組取6 只快速斷頭取腦,立即凍于液氮中,待測(cè)ChAT 活性。另6 只4 %多聚甲醛透心灌注后于4 %多聚甲醛溶液中固定72小時(shí)以上,進(jìn)行TUNEL 凋亡染色及NGF 免疫組化染色。

114 　ChAT活性檢測(cè)及定量分析　液氮中凍存腦組織分別取海馬、基底節(jié)、額葉、頂葉皮層制備5 %(V/ W) 腦組織勻漿, 按照Fonnum[6 ]的放免方法,在70μL 總反應(yīng)體積中,含試樣液或空白對(duì)照液20μL ,1114 g/ L 乙酰輔酶A(Sigma 公司) 10μL ,70 mmol/L 膽堿(Sigma 公司) 8μL ,1 mmol/ L 溴化新斯的明(Sigma 公司) 7μL ,3 mmol/ L 氯化鈉7μL ,317 ×104 Bq/ mL 14C2乙酰輔酶A 10μL ,在液體閃爍儀上測(cè)定每分鐘衰變數(shù)(cpm) 。以對(duì)照組各部位衰變數(shù)為100 % ,計(jì)算各組各部位ChAT 相對(duì)活性。

115 　TUNEL 凋亡染色及半定量分析　選取基底節(jié)、海馬、額葉、頂葉同時(shí)存在矢狀斷面切片,按TUNEL 凋亡染色試劑盒(武漢博士德公司) 說明書操作,進(jìn)行TUNEL 細(xì)胞凋亡染色。每只鼠腦染色2 張切片,每一切片高倍視野(400 ×) 下每部位取4 個(gè)視野共計(jì)數(shù)100 個(gè)神經(jīng)元,計(jì)算凋亡神經(jīng)元陽(yáng)性百分率,即神經(jīng)元凋亡指數(shù)(NAI) 。

116 　NGF 免疫組化染色及圖像分析　取上述石蠟切片,按NGF免疫組化試劑盒(武漢博士德公司) 說明書操作染色。每只鼠腦染色2 張切片,每一染色片高倍視野(400 ×) 下取5 個(gè)視野,用美國(guó)UIC 公司Metamorph Image System V416 圖像分析軟件得出陽(yáng)性染色細(xì)胞平均灰度值(Average gray value Average) 。

117 　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析　計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( x ±s) 表示,各組間ChAT 活性、水迷宮試驗(yàn)潛伏期、NGF 陽(yáng)性神經(jīng)元平均灰度值比較采用t 檢驗(yàn),神經(jīng)元凋亡指數(shù)組間比較采用χ2 檢驗(yàn)。

211 　Morris 水迷宮試驗(yàn)結(jié)果　各組逃避潛伏期分別為:對(duì)照組(1211 ±514) s ;Aβ注射后7 天組為(1411 ±519) s ,Aβ注射后14天組為(2116 ±617) s ,Aβ注射后28 天組為(4510 ±1013) s。Aβ注射后7 天潛伏期與對(duì)照組比較無變化,注射后14 天潛伏期延長(zhǎng)( P < 0105) ,注射后28 天潛伏期明顯延長(zhǎng)( P < 0101) ,提示大鼠學(xué)習(xí)記憶功能受損。

212 　Aβ腦室注射對(duì)ChAT 活性影響　Aβ腦室內(nèi)注射對(duì)腦內(nèi)ChAT 活性影響見表1 。

組　　別　　額葉基底節(jié)海馬頂葉

對(duì)　照　組1208. 5 ±49. 8 3662. 3 ±118. 5 2584. 0 ±98. 8 1184. 2 ±53. 2

Aβ注射后7 天1183. 8 ±26. 7 3559. 7 ±120. 3 2513. 0 ±99. 8 1139. 3 ±43. 6

Aβ注射后14 天1033. 4 ±47. 92)3507. 5 ±126. 6 2234. 2 ±84. 52) 1088. 3 ±63. 01)

AB 注射后28 天950. 1 ±67. 52)3228. 5 ±153.

02) 1833. 0 ±57. 62) 941. 8 ±42. 42)

　1) 與對(duì)照組比較, P < 0. 05 　2) 與對(duì)照組比較, P < 0. 01

　腦室內(nèi)注射Aβ7 天后,各部位腦組織ChAT 活性無明顯下降,

14 天后海馬、額葉ChAT 活性明顯下降,28 天后各腦區(qū)ChAT 活性均明顯下降( P < 0101) ,以海馬下降最明顯,降至對(duì)照組的71 %。

213 　Aβ對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡的影響　TUNEL 凋亡染色可見細(xì)胞核呈棕黃色染色的陽(yáng)性凋亡細(xì)胞,對(duì)照組及注射后7 天各腦區(qū)見個(gè)別散在凋亡細(xì)胞,Aβ注射后14 天可見少量凋亡細(xì)胞,28 天后明顯增多,NAI 升高,基底前腦Meynert 核區(qū)達(dá)1917 % ,海馬、額葉、頂葉分別為617 % ,512 % ,413 % ,Meynert 核區(qū)神經(jīng)元凋亡明顯多于海馬及皮層( P < 0101) 。Meynet 核凋亡染色見圖1 。

214 　Aβ對(duì)腦內(nèi)NGF 表達(dá)水平的影響　NGF 免疫組化染色于海馬、額葉、頂葉、基底前腦均可見胞質(zhì)黃褐色深染陽(yáng)性細(xì)胞,Aβ注射7 天后無明顯變化,14～28 天可見基底前腦區(qū)NGF 陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少,染色變淺,其他腦區(qū)NGF 表達(dá)水平無明顯變化�；�底前腦區(qū)NGF染色見圖2 。用美國(guó)UIC 公司Metamorph Image System V416 圖像分析軟件得出陽(yáng)性染色細(xì)胞平均灰度值(Average gray value) 。

組　　別　　額葉基底節(jié)海馬頂葉

對(duì)　照　組135. 48 ±17. 27 129. 67 ±18. 49 126. 87 ±9. 56 138. 46 ±13. 54

Aβ注射7 天后129. 32 ±14. 47 134. 57 ±10. 38 125. 48 ±8. 21 139. 76 ±9. 72

Aβ注射后14 天131. 21 ±17. 82 149. 65 ±9. 431) 129. 24 ±12. 59 128. 45 ±12. 43

Aβ注射后28 天126. 34 ±15. 97

175. 54 ± 12.

942) 116. 75 ±11. 16 128. 27 ±10. 03

　1) 與對(duì)照組比較, P < 0105 　2) 與對(duì)照組比較, P < 0101

　　近十多年積累的資料表明,前腦基底核的膽堿能神經(jīng)元、海馬和它們之間的通路,是學(xué)習(xí)記憶功能的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),損毀這些結(jié)構(gòu)或老齡化,可引起這些區(qū)域退化,導(dǎo)致智力嚴(yán)重缺損[7 ] 。ChAT 是ACh 的生物合成酶,存在于膽堿能神經(jīng)元中,是衡量膽堿能神經(jīng)元功能的標(biāo)志,也是AD 動(dòng)物模型成功的標(biāo)志性生化指標(biāo)[2 ,8 ] 。迄今為止,多數(shù)AD 物模型(如老年動(dòng)物代替模型、膽堿能系統(tǒng)損毀模型、轉(zhuǎn)基因小鼠模型) 是在模仿AD 早期出現(xiàn)的記憶障礙或病理特征,使其應(yīng)用受到局限。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠急性腦室內(nèi)注射Aβ1242 ,4 周內(nèi)大鼠水迷宮試驗(yàn)表現(xiàn)逐漸下降,出現(xiàn)了AD 表現(xiàn),與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9 ] 。腦內(nèi)海馬、基底節(jié),以及額葉、頂葉新皮層ChAT 活性均明顯下降,降至對(duì)照組水平70 %以下,說明Aβ腦室內(nèi)注射對(duì)腦內(nèi)ChAT 活性的影響是廣泛和明顯的。Aβ沉積是AD 發(fā)病的中心環(huán)節(jié)和病理特征,本模型全面模擬了AD 病理、行為學(xué)和生化改變,因此腦室內(nèi)Aβ注射可以作為一種理想的AD 模型制作方法。ChAT 活性的下降實(shí)際上反映了膽堿能神經(jīng)元功能的下降或變性,近年來越來越多的證據(jù)表明,膽堿能神經(jīng)元退化的主要方式也是細(xì)胞凋亡[3 ] 。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ChAT 活性降低的同時(shí),腦內(nèi)基底節(jié)、海馬等處的凋亡神經(jīng)元增多,并且以膽堿能神經(jīng)元聚集的基底前腦區(qū)更為明顯,所以ChAT 活性的降低可能源于Aβ所致的膽堿能神經(jīng)元凋亡�；�底前腦膽堿能神經(jīng)元發(fā)出纖維投射到海馬、邊緣葉及大腦皮層,這些部位靶細(xì)胞中產(chǎn)生的NGF 通過膽堿能神經(jīng)元的軸突末梢攝取后,經(jīng)軸漿逆向運(yùn)至其胞體所在的神經(jīng)節(jié),是基底前腦、隔區(qū)膽堿能神經(jīng)元的主要營(yíng)養(yǎng)因子。Aβ腦室內(nèi)注射后2 周開始,基底前腦神經(jīng)元NGF 含量減少,4 周時(shí)最明顯,推測(cè)在本模型中,由于NGF 對(duì)基底前腦中樞膽堿能神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)、支持作用減弱,導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)生凋亡,引起AD 的一系列行為學(xué)、生化改變。如果能采用基因治療等方法及時(shí)補(bǔ)充基底前腦NGF ,將有可能治療AD 癥狀,延緩AD 的進(jìn)展,目前基因治療AD 是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn),也是我們下一步的研究方向[10 ] 。綜上所述,Aβ腦室內(nèi)注射造成大鼠AD 樣行為學(xué)改變,腦內(nèi)ChAT 活性降低,基底前腦NGF 含量減少,膽堿能神經(jīng)元凋亡,可以作為AD 研究的動(dòng)物模型。