大鼠短暫腦缺血術后行為學的評價

摘  要: 目的  觀察大腦中動脈阻塞(MCAO) 2 h造成的短暫腦缺血大鼠(MCAO大鼠)行為學表現(xiàn)。方法  采用插線法阻塞成年SD大鼠大腦中動脈制作短暫腦缺血模型,分別對模型大鼠進行神經行為學、四肢協(xié)調性及學習記憶能力檢查;術后第14天處死大鼠取腦組織進行四氮唑紅(T TC)染色鑒定模型的成功與否。對照組不進行動脈阻塞。結果  術后1 h至第14天, MCAO 大鼠與對照組比較,在神經行為學、協(xié)調性及學習記憶能力等方面均有明顯的缺失和障礙( P< 0101) 。結論  采用插線法制作的大鼠短暫腦缺血模型操作簡單;術后動物行為學實驗是1種半定量分析,具有敏感、客觀的特點,能夠廣泛應用于各種實驗研究。

 

關鍵詞: 大腦中動脈阻塞; 短暫腦缺血; 行為學; Y迷宮實驗

 

缺血性腦血管病約占所有腦血管病的70 % ,與其他腦血管病相比,具有“三高一低”的特點,即高發(fā)病率、高致殘率、高復發(fā)率、低死亡率。我國每年新發(fā)病人數(shù)120萬～150萬,幾乎所有的病例均遺留不同程度的殘疾。從經濟學、社會學角度考慮,缺血性腦血管病對人類的威脅較其他類型的腦血管病更大。因此,對缺血性腦血管病而言,迫切需要尋找合理有效的治療措施。目前,對于神經細胞凋亡的研究多數(shù)來源于廣泛或局部腦缺血的動物模型,此模型的病理改變同人類的腦中風相類似,是一種較為成熟的動物模型,被廣泛應用于各種實驗研究中。通過對大腦中動脈的有效阻塞后的再灌注,使腦中特定部位發(fā)生壞死和凋亡。

 

本實驗試圖通過建立缺血2 h的大鼠短暫腦缺血模型,從大鼠的行為學表現(xiàn)和學習記憶能力兩方面對該模型作出評價,從而為進一步的治療效果提供合理的評價依據(jù)。

 

111 材料

雌性SD大鼠24只,體質量250～300g ,由中國科學院上海實驗動物中心提供。隨機分為2組: MCAO 大鼠12只,對照組12只。對照組只做手術但不插線栓塞血管。112 制備大鼠左側大腦中動脈栓塞模型大鼠用10 %水合氯醛麻醉(013 ml/ 100g) ,仰臥位取頸部正中切口,暴露頸總動脈、頸內動脈 、頸外動脈和翼腭動脈 。距頸總動脈分叉部10 mm處將頸外動脈用3 - 0絲線結扎;用3個動脈夾分別夾閉頸總動脈、頸內動脈和翼腭動脈。用1 ml注射器在頸外動脈上刺1個小孔(在頸外動脈結扎處至頸總動脈分叉部之間) ,用30 mm長、4 - 0尼龍線(尖端燒成圓形,以免刺破血管內壁)經此小孔插入,松開頸內動脈上的動脈夾,將插線經頸總動脈分叉處插入頸內動脈直至堵塞住大腦中動脈(從頸總動脈分叉處插入線長18～20 mm) 。90 min后,拔出插線。近心端結扎頸外動脈,松開頸總動脈和翼腭動脈上的動脈夾,肉眼可見血管內血流恢復。分層縫合手術切口,注意動物保暖。

 

113 行為學實驗

11311 神經行為學檢查:神經學缺失于大鼠缺血和再灌注后不同的時間段進行。具體時間為缺血后再灌注6 h , 1、2、3、7、10、14 d。2組大鼠隨機取6只,神經學檢查標準按照Lo nga等提出的進行評分: 0 分為正常; 1 分為栓塞動脈對側上肢不能完全伸展,而同側上肢正常; 2 分為栓塞動脈對側上肢屈曲,向對側推時抵抗力下降,沒有旋轉; 3 分為栓塞動脈對側上肢屈曲,向對側推時抵抗力下降,行走時向對側有輕度旋轉; 4 分表現(xiàn)為行走時向對側有嚴重旋轉; 5 分為大鼠身體倒向梗死對側。

 

11312 攀繩實驗:本實驗主要檢查大鼠雙前肢和雙后肢的協(xié)調配合能力。實驗于手術后2、3、7、10、14 d后進行。為完成實驗,大鼠需要具有運動學習的能力。取直徑115 cm的麻繩從高1 m、長和寬分別為1 5、5 0 cm的平臺上垂下,手術前1 d訓練每只大鼠,使之能夠爬到繩子的上1/ 3。

 

從術后第2天開始,每個測試日測試3次。評分的標準如下: 0 分,不需任何刺激在10 s內爬上平臺; 1 分,不需任何刺激在15 s內爬上平臺; 2分,刺激次數(shù)小于5次,在30 s內爬上平臺; 3分,刺激次數(shù)小于5次,在60 s內爬上平臺; 4分,刺激次數(shù)大于5次,在60 s內爬上平臺或是刺激小于5次,但爬上平臺時間超過60 s ; 5分,大鼠不能爬上平臺。

 

11313 Y迷宮學習記憶訓練及測試:動物分為3組, A、B 2組隨機取3只大鼠,另取3只同樣規(guī)格的正常大鼠作為對照。分別于手術后第3、4、1 4天 進 行 試 驗 。Y型 電 迷 宮 臂 長3 0 cm ,高1 5 cm ,寬1 5 cm。每臂末端有1 5 W信號燈示安全區(qū),箱底銅柵間隔4 mm。電流強度017 mA ,選用電壓38 V ,電擊延時2 s。設一臂為起步區(qū),按 Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ→Ⅰ臂順序輪流作為安全區(qū)。大鼠在起步區(qū)靜置3 min ,予以電擊致其逃至安全區(qū),燈光持續(xù)15 s ,然后熄燈休息45 s ,開始下一次操作。學習訓練及測試:規(guī)定大鼠受電擊后從起步區(qū)直接逃至安全區(qū)為“正確反應”,以達到連續(xù)10次電擊均為正確反應(即10/ 10)前所需的電擊次數(shù)(即嘗試次數(shù))表示其學習獲得能力(acquisi2tio n)。若嘗試次數(shù)超過30次則不再測試,并以30次為最大值計數(shù)。記憶再現(xiàn)(ret rieval)測試:選上述達到10/ 10標準的大鼠,休息24 h后再次同法測試,以達10/10標準前的嘗試次數(shù)表示記憶再現(xiàn)能力。

 

114 TTC染色

大鼠MCAO手術第14天, A、B組分別隨機取6只動物,用水合氯醛過量麻醉處死(500 mg/ k腹腔注射) ,經心臟灌注生理鹽水。在大腦耳間線前1 2 mm(為 額 葉 皮 質 的 感 覺 和 運 動 區(qū)) 至510 mm(為海馬中部)處切成腦片,片厚1 mm ,然后將腦片放入4 %四氮唑紅(2 , 3 , 5Ot rip henyltet razoliumchloride , T TC)磷酸鹽緩沖液中,3 7 ℃避光孵育30 min ,取出置于10 %多聚甲醛液中固定,拍照。

 

 

211 鼠術后神經行為學評分術后1h至第14天MCAO組大鼠和對照組大鼠的行為學表現(xiàn)相比較, 對照組明顯好于MCAO組 。2者 在 多 個 時 間 段 都 有 顯 著 差 異( P< 0101) , 隨著術后時間的推移,手術組大鼠的癥狀有所改善,但評分始終在2分以上,明顯存在不可逆的神經行為學損傷212 攀繩實驗結果術后第2～14天MCAO組大鼠和對照組大鼠的行為學表現(xiàn)相比較,對照組明顯好于MCAO組。2者在多個時間段都有顯著行差異( P <0101) , 隨著術后時間的推移, MCAO 組大鼠的癥狀有所改善,但評分始終在3分以上,明顯存在不可逆的神經行為學損傷(圖2) 。

 

213 Y迷宮試驗

Y迷宮測試結果顯示, MCAO 組大鼠在各個時間段在學習記憶能力方面均明顯低于對照組

( P < 0101)。

 

214 T TC染色的結果大鼠術后第14天, T TC 染色的結果顯示:MCAO組大鼠的腦組織梗死灶明顯,對照組腦組織沒有明顯梗死灶(圖4) 。

 

本實驗通過插線法制作大鼠短暫腦缺血模型,來觀察大鼠的神經行為學能力、四肢協(xié)調功能和學習記憶能力3方面的損傷情況。從術后1 h至第14天,在大鼠神經學評分、攀繩實驗和Y迷宮實驗中,均發(fā)現(xiàn)與對照組大鼠的顯著性差異( P< 0101) 。盡管隨著手術后時間的延長,這3項指標均有所好轉,但與對照組大鼠相比,差異始終具有顯著性,說明了腦損傷的不可逆性。在手術后第14天,處死大鼠進行腦組織T TC染色顯示了腦梗死體積仍然較大。梗死病灶的存在是大鼠行為學功能損傷的直接證據(jù)。本實驗所采用的攀繩實驗曾被作為評價酒精中毒動物的行為學損傷和評價外傷性腦損傷動物的行為學改變的依據(jù)。實驗動物在攀繩中的良好表現(xiàn)不但需要四肢的配合協(xié)調能力,而且還必須具有足夠的運動學習能力。本實驗中在14 d內5次進行測試,腦缺血大鼠在攀繩實驗中的表現(xiàn)有明顯的進步,而有研究證實2周或4周測試1次顯示大鼠的行為學改善不明顯。這表明損傷后的功能鍛煉將有助于神經功能的恢復。在靈長類動物中亦有類似的報道, 合理的解釋是損傷后的功能鍛煉能夠促進大腦皮質神經元神經突觸的連接形成。目前,有關短暫局灶腦缺血對大鼠學習和記憶能力的影響報道不一。有的學者認為MCAO手術只造成腦組織紋狀體和皮層的損傷,而海馬組織不受影響,因此記憶能力不受影響; 有人認為大鼠腦中參與學習和記憶的部位不僅限于海馬,皮層尤其是頂葉皮質在動物的學習和記憶過程中起到非常重要的作用。而MCAO手術后會造成頂葉皮層的損傷,故會導致大鼠的學習記憶能力降低。本實驗中Y迷宮測試結果與對照組比較顯示腦缺血大鼠的學習和記憶能力在手術后第3～14天顯著降低( P < 0101) 。作者認為,除了頂葉皮質損傷影響記憶功能外,可能的原因還有大鼠腦缺血過程中伴隨著大量炎性因子的釋放,包括氧自由基、一氧化氮等, 這些炎性因子的擴散會造成海馬組織的損傷從而影響記憶功能,但并沒有造成海馬組織顯著的病理學改變。綜上所述,本實驗采用插線法制作的大鼠短暫腦缺血模型操作簡單,效果可靠;術后動物行為學實驗是一種半定量分析,具有敏感、客觀的特點,能夠廣泛應用于各種實驗研究。