急性情緒應(yīng)激對大鼠行為和腦神經(jīng)顆粒素磷酸化水平的影響

摘　要　為探討急性情緒應(yīng)激對大鼠曠場行為的影響,以及腦神經(jīng)顆粒素(Neuroganin,NG)變化與應(yīng)激性行為效應(yīng)之間的相互關(guān)系。以急性不確定性空瓶刺激,建立情緒應(yīng)激動物模型。將40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為情緒應(yīng)激組1(ES1,接受情緒應(yīng)激和曠場測試)、情緒應(yīng)激組2(ES2,只接受情緒應(yīng)激)、正常對照組1(C1,無情緒應(yīng)激,但接受曠場測試)和正常對照組(C2,無情緒應(yīng)激,也無曠場測試) (n=10)。以曠場行為和高架十字迷宮任務(wù)來評定大鼠應(yīng)激后的行為變化,Western印跡雜交法(Westernblotting)測定海馬和前腦皮層中的NG含量和磷酸化水平。結(jié)

果表明: (1)應(yīng)激后ES1組的水平活動增加,與C1組比較,差異有顯著性, p<0. 01; (2) ES1組海馬和前腦皮層的NG磷酸化水平高于C1和C2組,差異有顯著性,均為p<0. 05; ES2組的前腦皮層NG的磷酸化水平高于C1組,差異有顯著性,為p<0. 05; (3)海馬的NG磷酸化水平與水平活動之間的相關(guān)達(dá)顯著水平。提示急性情緒應(yīng)激能導(dǎo)致動物明顯的行為改變?nèi)缃箲],這種行為改變可能與腦內(nèi)NG磷酸化水平的變化有關(guān)。水平活動可能是反映急性情緒應(yīng)激的較敏感行為指標(biāo),海馬NG磷酸化水平可能是預(yù)測急性情緒應(yīng)激所致焦慮或抑郁行為的較敏感生物學(xué)

指標(biāo)。

關(guān)鍵詞　急性應(yīng)激,情緒應(yīng)激,海馬,前腦皮層,行為,神經(jīng)顆粒素。

1　前言

　　迄今有關(guān)應(yīng)激引起行為改變的腦機(jī)制,包括所涉及的物質(zhì)分子、作用途徑和信號傳導(dǎo)方式所知甚少。以往的研究主要集中在神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)及功能的變化,也有用c - fos為探針進(jìn)行相關(guān)腦區(qū)的探索,但在應(yīng)激改變行為的腦機(jī)制的認(rèn)識上仍有許多謎團(tuán)。近年來,國內(nèi)外許多學(xué)者認(rèn)為突觸可塑性的改變就是應(yīng)激在中樞神經(jīng)系統(tǒng)留下的生物學(xué)“痕跡”,它會引起腦功能和行為活動的改變。應(yīng)激過程中,中樞突觸可塑性機(jī)制的變化是涉及情緒和行為障礙發(fā)生的重要中樞機(jī)制,包括突觸結(jié)構(gòu)可塑性和突觸功能可塑性機(jī)制的變化。前者是指相關(guān)腦區(qū)的神經(jīng)元的數(shù)量減少和細(xì)胞缺失、樹突棘萎縮等形態(tài)結(jié)構(gòu)的器質(zhì)性損害,其中海馬和前腦皮層是涉及應(yīng)激的最為重要的腦結(jié)構(gòu)。后者則是指蛋白信號傳導(dǎo)途徑缺陷、突觸傳遞效能障礙等,以中樞NR依賴性LTP的改變最受關(guān)注

　　由于中樞神經(jīng)元特異性蛋白質(zhì)及其磷酸化反應(yīng)對維持突觸結(jié)構(gòu)和功能,包括突觸的生長、發(fā)育、代償性變化和功能傳遞均具有十分重要的作用。所以,應(yīng)激后某些中樞神經(jīng)元特異性蛋白質(zhì)的含量和磷酸化水平變化,可能通過參與突觸結(jié)構(gòu)和功能可塑性機(jī)制的改變,涉及到應(yīng)激所致行為效應(yīng)的中樞機(jī)制。近期研究表明,某些表達(dá)于中樞神經(jīng)元的蛋白質(zhì)如熱休克蛋白70(Heat Shockprotein- 70, HSP- 70)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brainderivedneurotro2phicfactor,BDNF)、膜生長相關(guān)蛋白(thepresynaptic43- kDa growth- associatedprotein, GAP- 43),與應(yīng)激和某些精神障礙發(fā)生密切相關(guān),使得研究者們開始關(guān)注突觸特異性蛋白質(zhì)在應(yīng)激反應(yīng)的中樞機(jī)制中的可能角色。

　　神經(jīng)顆粒素(Neurogranin, NG)是一種神經(jīng)元特異性蛋白質(zhì),在與應(yīng)激、情緒和行為密切相關(guān)的腦結(jié)構(gòu)如皮質(zhì)、海馬和杏仁核中高表達(dá),是突觸后PKC的重要底物蛋白。研究發(fā)現(xiàn),NG參與中樞NR依賴性LTP, PKC、PKA和CaMKⅡ等多種重要的蛋白信號傳導(dǎo)途徑,通過介導(dǎo)突觸強(qiáng)度的改變,構(gòu)成誘發(fā)突觸可塑性表達(dá)的共同途徑的一部分,在突觸可塑性中具有關(guān)鍵作用。此外, NG能通過磷酸化水平的變化對中樞NR依賴性LTP過程產(chǎn)生明顯的影響,對某些應(yīng)激源的反應(yīng)敏感,并且與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)。因此,它可能涉及到應(yīng)激所致行為障礙的突觸結(jié)構(gòu)和功能可塑性機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn),慢性生理應(yīng)激和情緒應(yīng)激能導(dǎo)致動物行為異常以及NG含量的顯著下降,并且異常行為與NG含量的相關(guān)達(dá)顯著水平。表明慢性應(yīng)激后,NG含量下降是預(yù)測行為障礙發(fā)生的比較敏感的生物學(xué)指標(biāo),可能涉及慢性應(yīng)激所致行為障礙的中樞機(jī)制。上述研究結(jié)果提示, NG可能作為一9: 00～9: 10和晚21: 00～21: 10給動物飲水,之后撤掉水瓶,其余時間不給水。定時喂水期結(jié)束后開始應(yīng)激實(shí)驗(yàn), ES組動物在定時喂水時間內(nèi)給予的空

瓶刺激誘發(fā)其情緒應(yīng)激,刺激的給予是無規(guī)律的,但維持一天一次;應(yīng)激共持續(xù)3天。C1和C2組不接受任何處理,在籠中飼養(yǎng),自由飲水和攝食。所有動物在適應(yīng)期開始、適應(yīng)期末、定時喂水期末、應(yīng)激第3天共稱四次體重以考察應(yīng)激的程度。

2. 3　儀器和試劑

　　第一抗體抗NG總蛋白單克隆抗體、磷酸化NG多克隆抗體、β- Actin單克隆抗體、第二抗體辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體、山羊抗鼠IgG抗體、BCA(bicinchoninicacid)蛋白檢測試劑盒、全細(xì)胞裂解液(buffer)、硝酸纖維素膜(Nitrocellulosefilter,NC)均為Sigma公司產(chǎn)品,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(ECL)試劑盒購自美國Pierce公司。Gel. Doc凝膠成像半定量分析系統(tǒng)購自Bio- Rad公司。

2. 4　行為學(xué)測試

　　采用曠場測試和高架十字迷宮任務(wù)程序, ES1組和C1組動物在適應(yīng)期末和應(yīng)激期末共進(jìn)行兩次行為測試。

2. 4. 1　曠場測試　將動物置于高50cm、直徑180cm、周邊和底面均為黑色的圓形曠場中,光照度為60lux,室內(nèi)隔音。觀察者在行為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用攝像系統(tǒng)記錄動物在曠場內(nèi)5min的行為表現(xiàn),包括水平活動距離、直立、修飾、探究、呆滯和排便量。其中水平活動距離和探究通過行為跟蹤分析系統(tǒng)獲得數(shù)據(jù),直立、呆滯、修飾行為是根據(jù)行為攝像儀統(tǒng)計發(fā)生的次數(shù)。每只動物的排便量是以曠場試驗(yàn)結(jié)束后排便的顆粒數(shù)來表示。2. 4. 2　高架十字迷宮任務(wù)　裝置高50cm,開放吊臂為110cm×10cm×10cm(長×高×寬),閉合吊臂為110cm×50cm×10cm(長×高×寬)。測試于每天10∶00～14∶00h進(jìn)行。在測試開始時,大鼠被放

至迷宮的中間平臺上,面對迷宮的同一個開放吊臂。

測試時間為5min,記錄4個行為指標(biāo)。(1)進(jìn)入迷

宮開放吊臂總次數(shù), (2)在迷宮開放吊臂中停留時

間, (3)進(jìn)入迷宮閉合吊臂總次數(shù), (4)在迷宮閉合

吊臂中停留時間。

2. 5　海馬和前腦皮層NG的測定

　　應(yīng)激實(shí)驗(yàn)結(jié)束后次日,對ES1組和C1組大鼠進(jìn)行行為測試后,立即快速斷頭處死所有大鼠,剝離海馬和相同體積的前腦皮層組織,前腦皮層組織是根據(jù)大鼠腦圖譜確定的正中線靠近前外側(cè)的前額葉皮層組織(如圖1所示M1和M2區(qū)域)。之后將組織迅速用液氮冷卻。

　　采用Western印跡雜交法(Westernblotting)測定大鼠海馬和前腦皮層的NG含量和磷酸化水平。將組織加入buffer勻漿。勻漿后加入BCA液搖勻,在37℃水浴箱中溫育30分鐘,通過蛋白質(zhì)分光光度計進(jìn)行樣品海馬和前腦皮層總蛋白質(zhì)的初步定量,根據(jù)樣品總蛋白含量計算出每一樣品跑電泳所需加入的緩沖液量。勻漿中加入樣品緩沖液,走15%的聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)移至NC膜,NC膜以封閉液(10%脫脂奶粉,溶于TTBS)室溫封閉1h,用Tris/Tween緩沖鹽水(TrisbufferedTween- 20sa2line, TTBS)洗膜, 10min(3次。加入抗NG總蛋白單克隆抗體室溫孵育3h,再用TTBS洗膜, 10min(3次。TTBS液稀釋山羊抗兔IgG抗體(1: 4000)孵

育,室溫,振蕩1h,同樣洗膜3次。加入ECL熒光標(biāo)記,以膠片曝光顯跡。之后,對同一張NC膜上的內(nèi)參蛋白β- Actin和磷酸化NG進(jìn)行雜交。通過Gel. Doc凝膠成像半定量分析系統(tǒng)對膠片上的NG蛋白、磷酸化NG和β- Actin蛋白條帶進(jìn)

3　結(jié)果

3. 1　體重

　　適應(yīng)期開始、適應(yīng)期末、定時喂水期末和應(yīng)激期末,四組動物的體重總體比較差異無顯著性(p>0105)。但在應(yīng)激期內(nèi)(從定時喂水期末到應(yīng)激期末), ES1和ES2組動物體重增長非常緩慢。

3. 2　曠場行為測試

應(yīng)激前,兩組動物在曠場測試中水平活動距離、直立次數(shù)、修飾行為、呆滯行為和排便量的比較差異無顯著性(p>0. 05)�！�應(yīng)激后, ES1組表現(xiàn)出水平活動增加,與C1組比較,差異有顯著性(p<0. 01)。其余行為指標(biāo)的比較差異無顯著性。