采用CORTECS UPLC HILIC色譜柱開發(fā)ACh、HA及其代謝產(chǎn)物的UPLC/MS/MS定量測定法

采用CORTECS UPLC HILIC色譜柱開發(fā)一種能夠?qū)θ四X脊液(CSF)中乙酰膽堿、組胺及其代謝產(chǎn)物同時進行定量分析的UPLC/MS/MS定量測定法，從而提高峰分離度、靈敏度和分析速度

MaryE.Lame、ErinE.Chambers和KennethJ.Fountain 
沃特世公司(美國馬薩諸塞州米爾福德)

應用優(yōu)勢
■ CORTECS™UPLC® HILIC色譜柱的分離度可實現(xiàn)對ACh、HA及其代謝產(chǎn)物的同時定量
■ 總運行時間僅2.5min，符合高通量篩查需求
■ 96孔板的應用簡化了樣品制備(小于15min)
■ 較之先前的報道方法，高靈敏度的Xevo® TQ-SMS允許所用樣品體積更小，稀釋倍數(shù)更高

沃特世解決方案
ACQUITY UPLC®系統(tǒng)
Xevo TQ-S質(zhì)譜儀
CORTECS UPLC HILIC色譜柱
ACQUITY®收集板

關(guān)鍵詞
生物分析，生物標記物，腦脊液，定量，神經(jīng)遞質(zhì)，乙酰膽堿，膽堿，組胺，t-甲基組胺，t-甲基咪唑醋酸，UPLC，HILIC，CORTECS

簡介
在藥物研發(fā)中，來自體液的生化標記物常被用作診斷疾病和評估藥物療效的有效方式。乙酰膽堿(Acetylcholine,ACh)和組胺(Histamine,HA)是強極性神經(jīng)遞質(zhì)，存在于幾乎所有哺乳動物組織中。它們在睡眠調(diào)節(jié)、記憶、學習和免疫反應中發(fā)揮著一定作用^1-3。大腦中ACh水平下降會導致記憶功能障礙，尤其是阿爾茨海默氏癥患者的ACh供應明顯不足¹。因此，在這類認知障礙的治療中對于如何促進ACh的釋放進行了廣泛的研究。

組胺由組氨酸的脫羧作用生成。組胺或是被儲存起來，或是被其主要的降解酶組胺-N-甲基轉(zhuǎn)移酶或二胺氧化酶迅速滅活并代謝為兩種主要代謝產(chǎn)物t-甲基組胺(t-mHA)和τ-甲基咪唑醋酸(t-MIAA)。腦內(nèi)組胺參與廣泛的生理功能，例如睡眠-覺醒周期調(diào)節(jié)、喚醒、食欲控制、認知、學習和記憶^2,3。據(jù)了解，在精神分裂癥患者腦脊液中組胺的代謝產(chǎn)物增多^4,5。因此，腦脊液(CSF)中HA、t-mHA和t-MIAA的濃度可以作為腦組胺活性的指標。鑒于ACh、HA及其各自的代謝產(chǎn)物具有重要的生理學作用，其生理濃度變化的測量可作為疾病進展或藥物治療的評估指標，這一功能使得這類物質(zhì)成為藥物研發(fā)中非常重要的生化標記物。

開發(fā)ACh、HA及其代謝產(chǎn)物的靶向分析方法是人們一直以來面臨的挑戰(zhàn)，因為它不僅需要具備高靈敏度和高選擇性，還需要具有較快的樣品分析速度。此外，ACh、HA及其各自代謝產(chǎn)物之間的內(nèi)源性循環(huán)濃度存在極大差異，使得同時測定這些物質(zhì)需要較寬的定量動態(tài)范圍。雖然目前有多種用于定量這類分析物分析方法(GC/MS，HPLC-EC和LC/MS)^6-8，但很少有方法能夠同時測定嚙齒動物腦微透析液或CSF基質(zhì)中的ACh、HA及其各自代謝產(chǎn)物⁹。在含較高水相的洗脫條件下，分析物與基質(zhì)抑制組分可能會共流出并且MS電離能力較差，使得反相(RP)液相色譜法結(jié)合MS檢測的方法因靈敏度較低而受到限制¹⁰。親水作用液相色譜(HILIC)能夠提高極性物質(zhì)的色譜保留性能，可與反相色譜進行正交實驗用于極性和可電離化合物的分離，并能改善質(zhì)譜響應，正日益成為應對這些極性分析物分離挑戰(zhàn)的不二之選。

本文中介紹的方法展示了在96孔板中同時定量人CSF中的ACh、HA及其各自代謝產(chǎn)物。利用一步法樣品制備技術(shù)制備樣品，取20µL樣品進行稀釋，再執(zhí)行HILICUPLC/MS/MS分析。采用亞2µm顆粒的高效CORTECS UPLC HILIC色譜柱能夠?qū)崿F(xiàn)分析物與內(nèi)源性基質(zhì)的分離，提高分析靈敏度，分析時間只需2.5min，因此本方法快速、靈敏、準確且選擇性好，符合藥物開發(fā)的高通量生物分析需求。

實驗

樣品制備
20µL人工腦脊液(aCSF)標準品、aCSF質(zhì)量控制(QC)樣品或人腦脊液(含4mM毒扁豆堿)將QC樣品轉(zhuǎn)移至1mL的96孔板中。向樣品中加入含有濃度分別為1ng/mL的d4-乙酰膽堿、d4-組胺、d3-t-甲基組胺和d3-t-甲基咪唑醋酸(用作內(nèi)標(ISTD))的乙腈100µL。蓋上96孔板，并進行渦旋混合。然后，將樣品在4000rpm下離心5min，取10µL樣品進行UPLC/MS/MS分析。

UPLC條件
系統(tǒng)：  ACQUITY UPLC
色譜柱：CORTECS UPLC HILIC1.6µm，2.1mmX100mm(部件號186007106)
流動相A：100mM甲酸銨，pH3
流動相B： 乙腈
梯度：初始為90%的流動相B，在0.75min內(nèi)線性增加至60%，保持0.25min，然后在0.25min內(nèi)線性減少至30%，并保持0.65min。最后在1.9min內(nèi)返回至初始條件。
流速： 0.5mL/min
柱溫： 45℃
樣品溫度：6℃
進樣體積：10µL
運行時間：2.5min
收集板： Waters® ACQUITY1mL收集板

MS條件
質(zhì)譜儀：Xevo TQ-S
電離模式：ESI+
毛細管電壓：3.0kV
脫溶劑氣溫度：550℃
錐孔氣體流速：150L/h
脫溶劑氣流速：900L/h
碰撞室壓力：3.58X10 ^(-3)mbar
碰撞能量： 按組分優(yōu)化，見表1
錐孔電壓： 按組分優(yōu)化，見表1

數(shù)據(jù)管理
色譜分析：MassLynx®軟件
定量：   TargetLynx™軟件

結(jié)果與討論

質(zhì)譜分析
利用沃特世Xevo TQ-S質(zhì)譜儀在ESI-MS/MS正離子模式下對ACh、HA及其各自代謝產(chǎn)物進行檢測和定量。使用MassLynxIntelliStart™軟件自動優(yōu)化針對ACh、HA及其各自代謝產(chǎn)物和相應的氘代穩(wěn)定同位素標記形式(作為內(nèi)標)所選擇的多重反應監(jiān)測(MRM)通道，如表1所示。每個MRM通道駐留時間短至25ms，以及MS系統(tǒng)的快速掃描時間，使其能夠同時采集所有化合物峰并達到每峰數(shù)據(jù)點>/=10。

UPLC分離
ACh、Ch、HA、t-mHA和t-MIAA是以相對較低濃度存在的強極性小分子化合物，這使其難以通過常規(guī)的反相色譜進行檢測。此外，由于共流出的相關(guān)分子(如鹽類或其它低分子量內(nèi)源性組分)的基質(zhì)誘導干擾和離子抑制作用，導致對生物基質(zhì)中的這些內(nèi)源性分析物進行定量分析常常較為困難⁹。

在本應用紀要中，我們利用亞2µmCORTECS UPLC HILIC色譜柱和ACQUITY UPLC系統(tǒng)實現(xiàn)了ACh、HA及其各自代謝產(chǎn)物的色譜分離。確定最適宜的甲酸銨濃度(流動相A)為100mM(pH3)，流動相B由乙腈組成。在最佳流速為0.5mL/min、梯度為30%-90%B時，其在45℃的柱溫下分析循環(huán)時間為2.5min。

流動相添加劑的濃度對方法特異性、靈敏度以及將目標分析物與流動相和內(nèi)源性基質(zhì)進行色譜分離的能力具有重要影響。較高的緩沖液濃度100mM(而不是20至50mM)極大地改善了后洗脫分析物的峰寬。特別是高mM濃度的甲酸銨使t-MIAA的峰拖尾現(xiàn)象顯著減少。定量下限控制標準品(LLQC)中的ACh、Ch及其各自代謝產(chǎn)物，色譜保留時間和性能如圖2所示。ACh、Ch及其各自代謝產(chǎn)物和ACh的同分異構(gòu)體Iso-ACh(3-羧丙基)三甲基銨在1.35至1.75min內(nèi)洗脫，基線峰寬小于3.7s。

由于Iso-ACh(3-羧丙基)三甲基銨在腦中以較高濃度存在，因此本研究對其進行了分析。據(jù)報道，它是肉毒堿生物合成中的酶(G-甜菜堿羥化酶)的底物11。ACh和Iso-ACh為同分異構(gòu)體，在進行CSF中ACh的準確定量時確保二者的色譜分離度相當重要。在人CSF樣品提取物中(圖3)，突顯了存在的高濃度內(nèi)源性Iso-ACh。將ACh以1000pg/mL的濃度加標至人CSF中，以展示ACh和Iso-ACh之間的色譜分離和濃度差異。

樣品制備
選擇人工CSF(aCSF)作為替代基質(zhì)用于制備標準曲線，以對所有分析物進行定量。aCSF較容易獲得，且花費不像人CSF那樣高昂，因此，將其作為替代基質(zhì)更為實際。為了確保aCSF可作為合適的基質(zhì)用于所有分析物的準確定量，我們制備了ACh、HA和t-mHA的加標人CSFQC樣品，以及Ch和t-MIAA的aCSFQC樣品。Ch和t-MIAA的QC樣品由aCSF配制，是因為人CSF中內(nèi)源性基底水平的ng/mL濃度較高，使得難以通過標準品加入法在適用于其它分析物測定的線性范圍內(nèi)進行定量，因此需使用aCSF制備Ch和t-MIAA的QC樣品。此外，人CSF中Ch的ng/mL濃度較高，因此需要采用aCSF對樣品進行稀釋以便在動態(tài)檢測范圍內(nèi)進行準確定量。

如Zhang、Tingley、Tseng等人所述，所有人CSFQC樣品和人CSF樣品均含有最終濃度為4mM的穩(wěn)定劑毒扁豆堿，用于阻止ACh經(jīng)酶轉(zhuǎn)化為Ch和醋酸鹽。標準曲線、人CSFQC樣品、aCSFQC樣品和樣品均采用1mL96孔板制備。通過加入含實驗部分所述內(nèi)標的乙腈，進行一步法樣品稀釋(樣品量：乙腈量1：5)。使用96孔板可以在15min內(nèi)完成樣品制備，滿足了開發(fā)定量分析方法所需的高通量分析要求。

線性、精度和準確度
使用ACh、HA、t-mHA和t-MIAA的氘代穩(wěn)定同位素標記標準品(ISTD)進行定量分析。用d4ACh內(nèi)標進行Ch定量。ACh、Ch、HA、t-mHA和t-MIAA的標準曲線(1/x加權(quán))在定量動態(tài)范圍內(nèi)呈線性(>0.99)。各分析物的動態(tài)范圍、線性、平均QC準確度和定量下限(LLOQ)如表2所示。ACh的代表性校準曲線示于圖4中。

以人CSF和aCSF的混合物為基質(zhì)制備QC樣品，用于評估樣品內(nèi)精度和重現(xiàn)性。通過分析未加標的人CSF，測定ACh、HA和t-mHA的基底水平。通過從CSF源中扣除平均基底水平濃度得出相應的QC水平，從而測得QC濃度。ACh、HA和t-mHA的加標人CSFQC樣品分析，以及Ch和t-MIAA的加標aCSFQC樣品分析的代表性結(jié)果如表3和4所示。aCSF和人CSF校準定量完成后，利用aCSF標準曲線測定人CSF中各分析物的內(nèi)源性基底濃度。ACh、Ch、HA、t-mHA和t-MIAA的基底水平平均測定值匯總于表5中。準確度和精度值符合FDA關(guān)于LC/MS/MS檢測的法規(guī)標準^12,13。

結(jié)論  
■ 這種快速、簡單、靈敏且高選擇性的UPLC分析方法能夠?qū)θ薈SF中的ACh、HA及其各自代謝產(chǎn)物進行分離和同時定量。
■ 使用96孔板可以在15min內(nèi)完成樣品制備，提供了研發(fā)  階段分析方法所需的高分析通量。
■ CORTECS UPLC HILIC色譜柱的分離度和靈敏度改善了內(nèi)源性基質(zhì)組分的分離和分離度，所用分析時間僅2.5min。
■  Xevo TQ-SMS的高靈敏度使得只需少量樣品(20µL)和5倍的稀釋，即可達到低至10pg/mL的檢測限，并具有寬的定量動態(tài)范圍10-30000pg/mL。
■  所有分析物的QC樣品分析結(jié)果均符合FDA法規(guī)標準，變異系數(shù)為0.3%-10.1%，準確度范圍94.7%-113.7%，表明本方法的重現(xiàn)性和準確度良好。
■本文所介紹的方法展示出在藥物開發(fā)的研發(fā)階段對多種神經(jīng)性生物標記物進行高選擇性和高靈敏度定量的潛力。

參考文獻
1.  Jia JP, et al. Differential acetylcholine and choline concentrations in   the cerebrospinal fluid of patients with Alzheimer’s disease and vascular  dementia. Chin Med J (Engl). 2004; 117(8): 1161-4.
2.  Vohora D, Bhowmik M. Histamine H3 receptor antagonists/inverse agonists  on cognitive and motor processes: relevance to Alzheimer’s disease, ADHD,  schizophrenia, and drug abuse. Front Syst Neurosci. 2012; 6: 72.
3.  Jadidi-Niaragh F, Mirshafiey A. Histamine and histamine receptors in  pathogenesis and treatment of multiple sclerosis. Neuropharmacology.   2010; 59(3): 180-9.
4.  Ito C. The role of the central histaminergic system on schizophrenia.   Drug News Perspect. 2004; 17(6): 383-7.
5.  Alvarez EO. The role of histamine on cognition. Behav Brain Res. 2009;  199(2): 183-9.
6.  Prell GD, Green JP. Measurement of histamine metabolites in brain  and cerebrospinal fluid provides insights into histaminergic activity.  Agents Actions. 1994; 41: C5-8.