不同性別條件恐懼大鼠模型的行為比較

【摘要】  目的  探討不同性別條件恐懼大鼠的恐懼記憶保持和礦場行為是否存在差異。方法　利用巴甫洛夫經(jīng)典條件反射建立聲音+電擊,建立條件恐懼大鼠模型，于訓(xùn)練前1天及訓(xùn)練后第1、3、7、20天進(jìn)行恐懼記憶保持測和試曠場測試。結(jié)果　(1)恐懼記憶保持測試實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,雄性大鼠的恐懼記憶保持水平高于雌性大鼠，其僵立時(shí)間百分比在個(gè)時(shí)段均高于雌性大鼠，尤其在訓(xùn)練后訓(xùn)練后1天和訓(xùn)練后20天，雄性性大鼠為67.90±34.74與 27.4±22.51，雌性大鼠為23.60±21.10和3.10±3.07,存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。（2）曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,除修飾次數(shù)外，雌雄大鼠曠場行為比較存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。結(jié)論　雌雄條件恐懼大鼠存在行為學(xué)差異。  
【關(guān)鍵詞】  應(yīng)激　恐懼記憶保持　礦場行為   
    創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（post traumatic stress disorder,PTSD）是指在強(qiáng)烈的精神創(chuàng)傷后發(fā)生的一系列心理、生理的應(yīng)激反應(yīng)所表現(xiàn)出的一系列臨床綜合征。  
    PTSD臨床表現(xiàn)多樣，從臨床癥狀來看,其核心癥狀是創(chuàng)傷性記憶的不斷闖入導(dǎo)致恐懼情緒、逃避行為和過度喚起的生理反應(yīng)。有研究表明,社區(qū)普通人群中PTSD的終生患病率男性為5%,女性為10.4% 。普通人群中女性的患病率是男性的2倍。制備理想的模型是研究PTSD發(fā)生、發(fā)展規(guī)律機(jī)制的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。目前PTSD的動(dòng)物模型，多采用條件恐懼模型。一般認(rèn)為，雌性動(dòng)物由于生理周期的影響，在PTSD的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，制備動(dòng)物模型多采用雄性動(dòng)物，那么動(dòng)物雌雄間是否具有差異，未見報(bào)道。本研究中依照文獻(xiàn)所用的方法[3]，建立條件恐懼大鼠模型，觀察雌雄大鼠條件恐懼記憶保持及其行為活動(dòng)的差異。  
    1 材料和方法   
    1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料  
    健康成年Sprague-Dawley（SD）大鼠20只，雌雄各10只,體重200±30g,由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。自制足底電刺激控制箱，該裝置由電刺激箱、電壓控制儀一季聲音發(fā)生器組成。曠場行為觀察箱為90m×90m×45cm鐵皮箱,底被劃分為等面積的25格正方形方格。  

1.2實(shí)驗(yàn)器材

斯金納箱和條件性恐懼實(shí)驗(yàn)分析系統(tǒng)，上海欣軟信息科技有限公司提供，型號是XR-XC404。
1.2實(shí)驗(yàn)方法  
1.2.1條件恐懼大鼠模型制備  
        先將大鼠在動(dòng)物飼養(yǎng)室中適應(yīng)1周,室溫22～25 ℃, 分隔喂養(yǎng), 自然晝夜節(jié)律光照,通風(fēng)良好, 自由攝食、飲水。期間實(shí)驗(yàn)者每天撫摸大鼠5分鐘以使動(dòng)物適應(yīng)。并將大鼠放入電擊箱內(nèi)10分鐘，使其熟悉電擊箱并觀察大鼠行為。模型制備前一天，進(jìn)行一次曠場測試。所有的行為實(shí)驗(yàn)均在8:00AM- 12:30AM間進(jìn)行。  上海欣軟信息科技有限公司
    采取聲音信號提示結(jié)合電擊大鼠足底產(chǎn)生條件性恐懼的方法,制造創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙動(dòng)物模型。將大鼠放入電擊箱中，適應(yīng)3分鐘允許自由探索，3分鐘之后由揚(yáng)聲器輸出聲音信號（4.5kHz,80db；條件性刺激，conditioned stimulus CS）；持續(xù)30秒，在30秒聲音最后兩秒同時(shí)加以不可逃避的足底電刺激(40V～45V，10秒；非條件性刺激，unconditioned stimulus, US )，反復(fù)10次，兩次間隔1～4分鐘。當(dāng)給予聲音信號，動(dòng)物出現(xiàn)顯著僵立行為或逃避反應(yīng)，表示聲音信號提示的恐懼性條件反射建立。電刺激結(jié)束后動(dòng)物繼續(xù)在該箱中停留1～4分鐘然后放回日常飼養(yǎng)籠中。每只大鼠訓(xùn)練結(jié)束取出后及時(shí)地清理其排泄物，將電擊箱打掃干凈，并用90%酒精檫洗箱底。  
    1.2.2 行為學(xué)測定  
    1.2.2.1恐懼記憶保持測驗(yàn)  
    主要測定僵立行為（僵立行為是一種普遍見于嚙齒類的防御行為，表現(xiàn)為刻板式的蹲伏姿勢，大鼠外觀除呼吸運(yùn)動(dòng)以外其余的肌肉運(yùn)動(dòng)均消失，是大鼠恐懼表達(dá)的行為方式。于訓(xùn)練后第1、3、7天和訓(xùn)練后20天時(shí)觀察兩組大鼠情感行為改變，將大鼠放入電擊箱中，適應(yīng)3分鐘允許自由探索。然后，只予以聲音刺激而無電擊,其他條件同模型制作時(shí)，觀察3分鐘內(nèi)大鼠僵立時(shí)間，僵立時(shí)間之和占總時(shí)間的百分比即為僵立時(shí)間百分比。間隔0.5-1min 后，重復(fù)上操作，連續(xù)5次。  
    1.2.2.2曠場實(shí)驗(yàn)(Open-field test )  
    于訓(xùn)練前1天及于訓(xùn)練后第1、3、7天和訓(xùn)練后20天時(shí)各組大鼠進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)在安靜、光線較暗的環(huán)境中進(jìn)行, 將大鼠輕輕放入曠場行為觀察箱中央小方格內(nèi)，觀察3min內(nèi)大鼠的情感行為情況:①大鼠運(yùn)動(dòng)活性：穿行格數(shù), 指三爪以上跨入鄰格的次數(shù)；②探究行為: 直立次數(shù),指兩前爪騰空1cm 以上或攀附墻壁次數(shù)；   
    1.3數(shù)據(jù)處理  
    采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均由（x-±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)確定組間差異，檢驗(yàn)結(jié)果以P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。  
    2　結(jié)果  
    2.1恐懼記憶保持測驗(yàn)結(jié)果  
    大鼠在重新置入電擊箱中呈明顯僵立行為。雄性大鼠在不同的時(shí)間點(diǎn)僵立時(shí)間百分比均明顯高于雌性大鼠。尤其在訓(xùn)練后訓(xùn)練后1天和訓(xùn)練后20天差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表1。  
    條件恐懼大鼠模型恐懼記憶保持測試僵立百分比()  
    與雌性比較  * P<0.05  
    2.2曠場實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果  
   在曠場實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)前后對比，大鼠直立次數(shù)減少( P<0.05)，糞便粒數(shù)增加( P<0.05)。雌性大鼠穿行格數(shù)也減少、而雌性大鼠格數(shù)先增加然后呈波動(dòng)性減少。雌雄兩組間在再次穿行格數(shù)、直立次數(shù)，雌性大鼠明顯高于雄性，單因素方差分析顯示雌雄兩組間曠場測定結(jié)果不同的時(shí)間點(diǎn)也存在顯著差異。  
    條件恐懼大鼠模型曠場實(shí)驗(yàn)穿行格數(shù)()  
    與雌性比較  * P<0.05  
   條件恐懼大鼠模型曠場實(shí)驗(yàn)直立次數(shù)()   
    3　討論  
    文獻(xiàn)顯示，通過條件反射性恐懼訓(xùn)練建立恐懼記憶模型，應(yīng)激相關(guān)的創(chuàng)傷事件刺激可以觸發(fā)恐懼性記憶的提取，提高動(dòng)物警覺性和回避反應(yīng)。     
    一方面,從以前PTSD動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究來看,一般認(rèn)為對嚙齒類動(dòng)物而言, 僵立行為是動(dòng)物在面臨負(fù)性相關(guān)刺激無法避免時(shí)的一種防御反應(yīng)，被認(rèn)為是一種反映恐懼的可靠指標(biāo)。從表1中可知,本研究的大鼠經(jīng)條件恐懼訓(xùn)練以后，不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行恐懼記憶保持測驗(yàn),動(dòng)物的僵立時(shí)間百分比基本增加，這可以說明本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型對條件刺激尤其是雄性大鼠獲得了恐懼記憶并長期保持，模型較好地模擬了PTSD的核心癥狀—病理性恐懼記憶增強(qiáng)。在本實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物的僵立時(shí)間百分比隨著時(shí)間的增加總體呈下降趨勢，說明條件恐懼記憶隨時(shí)間增加會逐漸消退，而恐懼保持測試,既可喚起恐懼記憶促進(jìn)恐懼記憶再鞏固同時(shí)也可以促進(jìn)條件恐懼記憶消退。但雌雄大鼠之間相比較，在不同的時(shí)間點(diǎn)雄性僵立時(shí)間百分比均明顯高于雌性，這也許可以解釋成同樣的創(chuàng)傷性刺激在動(dòng)物中，雌性可能更能耐受，恐懼程度較雄性低，創(chuàng)傷性記憶較容易消退。  
    Hall(1934)首先將曠場反應(yīng)作為動(dòng)物恐懼、緊張情緒的重要指標(biāo)。曠場行為分析主要反映動(dòng)物對新環(huán)境的探索、習(xí)慣以及伴隨的情緒變化，跨格次數(shù)及直立次數(shù)是動(dòng)物探索行為及興奮性的反映。目前有一些研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物在因應(yīng)激而產(chǎn)生緊張、恐懼（情緒性）時(shí)會發(fā)生走格減少，僵立、卷縮等現(xiàn)象。從表2看，兩組動(dòng)物跨格次數(shù)及直立次數(shù)隨實(shí)驗(yàn)天數(shù)的增加總體上基本呈逐漸降低并且都較處理前顯著減少，表明動(dòng)物對新環(huán)境逐漸熟悉，但雌性大鼠各時(shí)間點(diǎn)的跨格次數(shù)及直立次數(shù)均高于雄性大鼠，雄性大鼠的興奮性較雌性大鼠低，對環(huán)境的適應(yīng)性相對變差。  
    本實(shí)驗(yàn)僅就不同時(shí)間條件恐懼雌雄大鼠恐懼記憶保持及其曠場行為活動(dòng)的差異作了初步比較,聲音+電擊制備的大鼠條件恐懼大鼠模型，均有顯著的行為異常，且異常程度在雌雄大鼠之間存在差異。