濾光片在共聚焦顯微鏡上的應(yīng)用
由于對(duì)孔徑的獨(dú)特的布置，共聚焦顯微鏡探測器所提供的圖像對(duì)應(yīng)于一個(gè)薄的光學(xué)切片或是樣品的截面。例如，一個(gè)幾毫米厚的樣品在焦平面處沿z軸降至少于微米。
共聚焦處的光照?qǐng)鐾ㄟ^一個(gè)被稱為針孔的孔徑所限制。視場同樣也受到一個(gè)針孔的限制，針孔的位置是相對(duì)于第一個(gè)孔徑與照射點(diǎn)共軛的像平面上。這種共聚焦配置的結(jié)果就是降低了對(duì)散焦光的探測，從而通過減少成像容積來增加信噪比。
Marvin Minsky首先設(shè)計(jì)了共聚焦顯微鏡并在1957年的一份專利中描述了一個(gè)通過移動(dòng)照射光束平臺(tái)來實(shí)現(xiàn)的。從樣品發(fā)來的調(diào)制光被送往光電管用示波器觀察。光照射及隨后的探測是通逐點(diǎn)地過移動(dòng)平臺(tái)來實(shí)現(xiàn)的。Minsky的極具原創(chuàng)性的構(gòu)想最終徹底改變了顯微鏡。
Minsky的專利被通過的時(shí)候，還是存在有幾個(gè)技術(shù)難點(diǎn)。由于限制孔徑，他的系統(tǒng)需要非常強(qiáng)的光源。鑒于由針孔損失的光強(qiáng)，在當(dāng)時(shí)激光并不存在，并且也沒有其他足夠強(qiáng)的光源來激發(fā)熒光。在那時(shí)候Minsky使用的是長期持久的示波器做觀測，因此沒有辦法如實(shí)記錄圖像。導(dǎo)致其他發(fā)明者對(duì)這一特殊的顯微鏡做進(jìn)一步的發(fā)展成為對(duì)普通研究者的有效工具。
發(fā)展強(qiáng)烈的單色光源—激光—解決了照射的問題。計(jì)算機(jī)裝備了數(shù)字化儀之后，使記錄和現(xiàn)實(shí)圖像變得輕而易舉。如今，現(xiàn)在掃描共焦使用激光或結(jié)合激光作為照射光源。這種掃描是通過精確控制振鏡以光柵運(yùn)動(dòng)的方式，用最小光斑掃過視場，就像通過電腦控制電視一樣。從樣品散射或反射的熒光信號(hào)被發(fā)送到光電倍增管(PMT)，這是一次形成圖像在屏幕上的一個(gè)點(diǎn)(像元素、像素點(diǎn))。
雖然Minsky羅列了共聚焦的許多優(yōu)點(diǎn)，或許最重要的功能就是掃描共聚焦顯微鏡能夠?qū)悠愤M(jìn)行光學(xué)截面成像。傳統(tǒng)上，通過固定組織然后仔細(xì)地將其切片成以便觀察和成像的薄層，來獲取細(xì)胞或組織的精細(xì)結(jié)構(gòu)。這個(gè)過程需要將樣品處死，并且需要研究人員花費(fèi)好幾年時(shí)間去學(xué)習(xí)切片技術(shù)才能將樣品切割到成像所需的足夠薄的厚度。
共聚焦的光學(xué)切片性能允許用戶對(duì)厚組織成像而不需要特殊的切片技巧。它還允許用戶對(duì)活的細(xì)胞、組織以及生物體進(jìn)行超高分辨率成像�；铙w細(xì)胞成像已經(jīng)成為共焦顯微鏡的一個(gè)重要組成部分。
這種光學(xué)切片的能力也意味著單張切片/圖像可以保存到計(jì)算機(jī)，然后還可以將圖片重組為樣品的三維圖像。這在現(xiàn)有的激光掃描系統(tǒng)中是非常重要的特征。
此系統(tǒng)在熒光成像中會(huì)采用一些特殊的光學(xué)元件。一個(gè)常見的誤解認(rèn)為激光器產(chǎn)生的激光輸出只有一個(gè)波長。實(shí)際上幾乎所有的激光器都將產(chǎn)生諧波或散射其他波長光。雖然這些次波段的光跟主波段相比強(qiáng)度很弱，但是他們還是可以大大降低信噪比。如果熒光的發(fā)射波段正好落在激光諧波的范圍內(nèi)(或是來自激光的其他雜光)，那么熒光信號(hào)可能會(huì)完全被掩蓋掉而探測不到。
光路中的首要器件就是激光純化濾波片，這就是經(jīng)修飾過的激發(fā)光濾波片。由于激光的相干性和相對(duì)較小的光束以及光路準(zhǔn)直的要求，這些鏡片都是要經(jīng)過研磨和拋光處理的。這就與寬場顯微鏡形成鮮明的對(duì)比，因?yàn)閷拡鲲@微鏡不需要研磨和拋光。純化鏡片還應(yīng)具有很好的傳輸特性，包括波前畸變要少于每英寸一個(gè)波長。偏離角(與鏡片外緣理想平行線的偏差)應(yīng)盡量減小到小于一個(gè)弧度角分，這樣在同一個(gè)系統(tǒng)中使用不同純化濾波片的時(shí)候就不必重新矯正了。
一個(gè)純化濾波片的半波寬度(FWHM)通常是在10nm左右。它會(huì)阻塞激光光源的其他雜光(最大范圍會(huì)從紫外光到1200nm)和減反射涂層來達(dá)到最大傳輸。
隨著更新、更強(qiáng)的激光器的出現(xiàn)，利用增透膜來增加透過率就顯得沒有必要了。然而，這些光學(xué)器件采用最大反射的干涉涂層以避免熱損傷，增透膜將因此減少表面反射。這些反射光不能被反射進(jìn)入激光器的共振腔。因此，這些光件被設(shè)計(jì)用于入射角(AOI)在3.5度到5度之間。二極管激光器在熱身之后所發(fā)射的光的波長會(huì)有輕微的變化，因此，我們建議為這些光源配備20-25nm寬的純化濾波片。在共聚焦系統(tǒng)和普通熒光顯微系統(tǒng)中，為了獲得較好的平面平整度，它們必須克服波前像差。雖然兩種系統(tǒng)的波前像差都控制在每英寸一個(gè)波的范圍內(nèi)，但在共聚焦系統(tǒng)中選擇二向色鏡顯然可以獲得更好的效果。
目前，要4-6m厚的熔融石英基片上實(shí)現(xiàn)二向色性已經(jīng)很常見了，但越來越多的需求需要用更厚的基片來消除波前像差并實(shí)現(xiàn)二向色性。
在過去幾年時(shí)間里，隨著激光器的規(guī)模做得越來越大，也會(huì)有這些越來越大的功率負(fù)載可能會(huì)摧毀主鏡方面的擔(dān)心。這對(duì)于設(shè)計(jì)良好的二向色鏡來說不成問題，對(duì)常見大小的光束負(fù)載至少達(dá)到8-10瓦特的功率。通過增透膜來最大限度的減小聚束光的反射使透射率最大化。
偏振也是濾鏡要考慮的另一個(gè)因素。因?yàn)樗械墓饧䦟?duì)光路有偏轉(zhuǎn)角度時(shí)都可以充當(dāng)偏振鏡，這對(duì)大多數(shù)偏振激光來說就顯得尤為重要。
所有熒光發(fā)射濾鏡的主要作用就是阻止激發(fā)光的透過。相比較于熒光顯微鏡而言，對(duì)于共聚焦系統(tǒng)，這種阻塞并不包含很寬的光譜范圍。然而，由于激光束的高功率輸出，需要對(duì)激光發(fā)射的特定波長專門設(shè)計(jì)更大的阻塞(或許高于OD 8)。
對(duì)共聚焦系統(tǒng)發(fā)射濾鏡的實(shí)際設(shè)計(jì)還是存在一些爭議。由于大多數(shù)探測器采用光電倍增管(PMT)，圖像一次采集只形成一個(gè)像素(圖像元素)，這些濾鏡光件就不需要打磨和拋光。但由于共聚焦成像對(duì)分辨率的要求越來越高，就像其他發(fā)射濾波片一樣經(jīng)過打磨和拋光并不是在浪費(fèi)精力。近期一些證據(jù)表明，發(fā)射濾波片具有較大楔形時(shí)(光束變差)可能會(huì)造成形態(tài)學(xué)測量的不準(zhǔn)確，這種不準(zhǔn)確在長發(fā)射光路中可能會(huì)更嚴(yán)重。
激光系統(tǒng)的濾波片光具座是圍繞激光發(fā)射而設(shè)計(jì)的，并不一定針對(duì)特定熒光染料的最大或激發(fā)。這確實(shí)帶來有關(guān)的幾個(gè)問題，什么樣的熒光染料才適合特定的激光系統(tǒng)。幸運(yùn)的是，現(xiàn)在從熒光染料的供應(yīng)商那里可以獲得更多的選擇了。另外也可以選擇使用可以方便和快速反射多個(gè)激光束的多色主鏡。
