色譜柱沖洗的那些事兒（反相色譜柱）

衣服穿久了要洗，色譜柱用久了要沖，不過沖洗色譜柱可不像洗衣服那么簡(jiǎn)單，到底該怎么洗，還是有些門道的：

第一個(gè)問題：用什么沖
1.1：什么叫沖洗色譜柱
通常，色譜柱沖洗就是把色譜柱上的臟東西和對(duì)色譜柱有損壞的東西沖出來，并且保存在合適的溶劑中；還有另一種情況，也可以算作沖洗的范疇，就是梯度方法間重新平衡色譜柱的過程。
1.2：常用的溶劑
針對(duì)于反相色譜柱，通常是用到純的水和有機(jī)溶劑，水主要是作為沖洗掉色譜柱中的鹽和其他添加劑，而有機(jī)溶劑則是用來沖洗掉一些在色譜柱上有較強(qiáng)保留的污染物，除了在分析中常用到的甲醇和乙腈之外，還有一些對(duì)污染物去除能力更強(qiáng)的有機(jī)溶劑也可以使用，比如異丙醇。

第二個(gè)問題：沖多久
色譜柱到底要沖多久，這個(gè)是經(jīng)常困擾大家的問題，20分鐘，30分鐘，還是一個(gè)小時(shí)？
2.1.1：色譜柱沖洗的計(jì)算原理
其實(shí)，沖洗色譜柱并不是一個(gè)時(shí)間概念，而是一個(gè)體積的問題：通常要完全置換色譜柱中的流動(dòng)相，需要至少十倍柱體積，也就是說，要有至少十倍于色譜柱體積的溶劑流過色譜柱才能把里面原有的溶劑徹底置換。
2.1.2：色譜柱體積的計(jì)算
色譜柱的柱體積就是色譜柱的圓柱型體積乘以色譜柱柱填料的孔隙率（一般約為0.6），所以算下來，一根常用的4.6×150mm的色譜柱柱體積大約是1.5mL，如果是10倍柱體積的量，就是15mL，按照常用的1mL/min的流速，就是15min的時(shí)間。
2.2.1：梯度重新平衡的沖洗時(shí)間
不過，這僅僅是置換所有溶劑的時(shí)間，其實(shí)僅僅是適合于短期沖洗色譜柱，比如梯度方法間的平衡時(shí)間，但是這還要受到儀器延遲體積的影響，已經(jīng)流動(dòng)相是否容易重新達(dá)到化學(xué)平衡的考慮，通常儀器的延遲體積越大，這個(gè)時(shí)間要越長(zhǎng)，如果所使用的流動(dòng)相不容易達(dá)到化學(xué)平衡，還要加長(zhǎng)時(shí)間，比如使用使用某些緩沖鹽的情況。當(dāng)然也后很多情況下，梯度方法間的平衡時(shí)間是不需要這么長(zhǎng)的。
2.2.2：清潔色譜柱的沖洗時(shí)間
如果需要徹底沖洗色譜柱，還需要更長(zhǎng)的時(shí)間，通常建議是20倍的柱體積，也就是說，對(duì)于4.6×150mm的色譜柱，要沖30分鐘才能保證沖洗完全。其他規(guī)格的色譜柱可以根據(jù)色譜柱的規(guī)格和流速進(jìn)行簡(jiǎn)單的計(jì)算。

第三個(gè)問題：怎么沖
色譜柱的沖洗，無非兩個(gè)情況：正常情況下的沖洗和非正常情況下的沖洗
3.1：正常情況下色譜柱的沖洗步驟
3.1.1：使用不含添加劑流動(dòng)相后的沖洗
正常情況下，僅僅是對(duì)色譜柱進(jìn)行流動(dòng)相替換和凈化，對(duì)于一般的方法，只需在方法結(jié)束后使用高比例的有機(jī)相比如甲醇或者乙腈沖洗色譜柱大約20倍柱體積即可。
3.1.2：使用含鹽或添加劑后的沖洗
如果是使用的到的方法的流動(dòng)相中含有緩沖鹽或者其他添加劑的時(shí)候，先要使用和方法流動(dòng)相起始比例相同的純水相替代緩沖鹽一相，沖洗20倍柱體積之后，再換上高比例有機(jī)相沖洗20倍柱體積。
3.1.3：色譜柱沖洗后的保存
對(duì)于色譜柱的保存，一般是存放在純的有機(jī)相中，短期存放，甲醇乙腈均可，長(zhǎng)期存放，建議儲(chǔ)存在甲醇中。

3.2：非正常狀況下的沖洗
如果是非正常的狀況，就要考慮一些不走尋常路的沖洗辦法了：
什么叫做非正常狀況？常見的有兩種，柱效下降和堵塞：
3.2.1：柱效下降色譜柱的沖洗
對(duì)于柱效下降，我們首先要確定是色譜柱的問題而不是由于儀器或分析方法造成的，排除這兩者，如果不是色譜柱損壞比如塌陷（物理沖擊造成），鍵合相水解（高溫低pH下長(zhǎng)時(shí)間使用），硅膠基質(zhì)水解（高pH下使用）等不可逆損傷造成的柱效下降，因?yàn)榕懦�上述問題外，多數(shù)情況都是因?yàn)樯�譜柱不太正常的“臟”了，可以首先使用純的甲醇或乙腈長(zhǎng)時(shí)間沖洗色譜柱，如果還不能奏效，可以考慮使用純的異丙醇沖洗色譜柱，異丙醇的洗脫能力比甲醇乙腈更強(qiáng)，能把很多這兩種溶劑無法沖洗的污染物從色譜柱上洗脫下來。如果效果仍舊不明顯，可以參考色譜柱說明書中的“色譜柱再生”一項(xiàng)里面的說法，使用更加強(qiáng)大的溶劑沖洗，不過這些溶劑通常不是常用的反相液相色譜溶劑。
3.2.2：堵塞色譜柱的沖洗
如果是遇到堵塞的情況，首先要確定堵塞是由于什么原因引起的，如果是由于色譜柱中殘留的緩沖鹽引起的，這是最萬幸的堵塞了，可以嘗試用高比例的水相（推薦95%）在較高的溫度下沖洗色譜柱。
如果是由于樣品原因?qū)е律�譜柱堵塞，又要考慮另外的辦法，如果是樣品中含有太多吸附性很強(qiáng)的物質(zhì)（有時(shí)是復(fù)雜樣品中的某些雜質(zhì)，無法通過過濾離心等辦法去除）沉積吸附在柱頭導(dǎo)致堵塞，可以嘗試使用不同的溶劑（對(duì)此類物質(zhì)有較好溶解性的）慢慢沖洗。
如果是由于樣品過濾不當(dāng)或者樣品在色譜柱上析出導(dǎo)致某些顆粒雜質(zhì)堵塞了色譜柱，除了嘗試尋找合適溶劑沖洗之外，只能考慮反沖了，通常，不建議反沖色譜柱，因?yàn)榭赡軐?duì)色譜柱造成較大損害，所以反沖是迫不得已的死馬當(dāng)活馬醫(yī)的辦法，一定要慎用。做好樣品的前處理并使用預(yù)柱或在線過濾器才是保護(hù)色譜柱的好辦法！
3.3：快速?zèng)_洗色譜柱
看上去很好很強(qiáng)大的說法，其實(shí)很簡(jiǎn)單，在沖洗色譜柱的時(shí)候，可以通過增加流速來縮短沖洗時(shí)間，我們已經(jīng)知道色譜柱沖洗的完全程度是通過體積衡量的，所以提高流速是可以節(jié)省下時(shí)間的。但是要特別注意的是，對(duì)于堵塞的色譜柱，提高流速可能并不是個(gè)很可行的辦法...