高速離心機(jī)分離血清脂蛋白

用電泳法分離含載脂蛋白較高的組份(HDL，VHDL)比較成功，而離心分離法則適合用于各種密度的血清脂蛋白分離。

血清脂蛋白是由血液中脂質(zhì)與某些特異的蛋白質(zhì)組成的一類不均一的復(fù)合物。因其所含脂與載脂蛋白的比例不同，其密度范圍在0.96g/ml或更低至1.21g/ml之間。紙電泳中顯示四條帶即：乳密顆粒，極低密度脂蛋白，低密度脂蛋白，高密度脂蛋白。每種脂蛋白還可以分為更多的亞組分。

一．梯度材料：血清脂蛋白密度較低，常用的梯度材料為Nacl,NaI,Kbr,KI等，常用的緩沖劑為ED。

二．預(yù)分離：

1.血細(xì)胞與血清分離：

離心參數(shù)：全血，角轉(zhuǎn)頭，3，000rpm×20min

結(jié)果：沉淀為血細(xì)胞，上部為血清。

2.乳糜粒分離：禁食12小時以上人血漿中乳糜粒含量極少，已進(jìn)食者因其血漿含乳糜粒高，應(yīng)先離心去除乳糜粒。

離心參數(shù)：4×10(g×min),10°C.各種轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速均可。

梯度液配置：離心管下部3/4容積加血漿，上部1/4容積加0。5MnaCl 0.3MEDTA,ph7.4

結(jié)果：乳糜粒上浮，吸出。

3.血清蛋白分離：除去球蛋白，白蛋白及其它蛋白質(zhì)。

離心參數(shù)：(2。5-3)×10(g×hr),各種轉(zhuǎn)頭均可。如角轉(zhuǎn)頭70，000rpm×6hrs,10°C

配置：管容量1/3為血清，2/3為1。31g/ml,NaCl NaBr,攪拌后終密度為1。21g/ml

結(jié)果：管上部1/6容積為血清脂蛋白，下部5/6為其它蛋白。

三．方法：

1．順序浮選法：

a)超速法：最早使用的方法，4000rpm×24hrs×3次，10°CNaCl NaBr梯度按1。006，1。063，1。21順序浮選，每次在管上部取出不同密度之

脂蛋白。操作簡單，分辨率高，得率高，費時，成本高。

b)超高速法：100，000rpm×2.5hrs×2次，10°C,100，000rpm×4hrs×1次，NaCl KBr EDTA梯度按不含密度浮選出VLDL，LDL，HDL

2．單次離心法：

a)單次水平分離

用最高轉(zhuǎn)速為25，000~28，000rpm,6×40ml甩平轉(zhuǎn)頭以1.006g/mlNaCl液及1。35g/ml(NaCl KBr EDTA)液配置成從1。006至1。21的8層不

連續(xù)階梯度，最下部用血清與KBr配成1。25g/ml樣品液，25，000rpm×4hrs,4oC一次得到VLDL，LDL，HDL不同層區(qū)帶。

用最高轉(zhuǎn)速為40，000rpm，6×13ml甩平轉(zhuǎn)頭，40，000rpm×24hrs，20°C，不連續(xù)KBr梯度1.006~1.21g/ml,細(xì)長管，分層清晰，回收率

高，離心時間長

b)單次垂直管分離：

NaCl/KBr或NaCl/NaBr不連續(xù)梯度單管容量從5ml到40ml，轉(zhuǎn)速從50，000rpm~80，000rpm，離心(0。5-3)hrs,下層用KBr或(NaBr)將血清調(diào)至1

。3g/ml上層用1.006g/ml,NaCl液，10°C-20°C，增加，減速一次分出。NaCl/Sucrose不連續(xù)梯度下層為48%W/WSucrose,中層血清在4MnaCl

中，上層為0。67MNaCl 0.05%EDTA,離心參數(shù)同上，時間較長。

c)區(qū)帶轉(zhuǎn)頭大容量分離：

離心參數(shù)：區(qū)帶轉(zhuǎn)頭，最高轉(zhuǎn)速30，000~48，000rpm,容量從650ml~1900ml,每次可分離血清50-150ml,低速加樣及卸載，分離轉(zhuǎn)速：大轉(zhuǎn)頭

(25,000-28,000rpm)×24hrs，小轉(zhuǎn)頭(30,000-38,000rpm)×1hrs，10°C-20°C

梯度液：NaCl NaBr或KBr EDTA不連續(xù)或線性梯度，樣品在最大密度層，近轉(zhuǎn)頭核心處用純水做隔離層，分離室最外部用高密度NaCl/KBr或

NaCl/NaBr作緩沖層。