水環(huán)境污染生物監(jiān)測(cè)——生物測(cè)試法

水環(huán)境污染生物監(jiān)測(cè)——生物測(cè)試法

利用生物受到污染物危害或毒害后所產(chǎn)生的反應(yīng)或生理機(jī)能的變化來評(píng)價(jià)水體污染狀況，確定毒物安全濃度的方法稱為生物測(cè)試法。該方法有靜水式生物測(cè)試和流水式生物測(cè)試兩種。前者是把受試生物放于不流動(dòng)的試驗(yàn)溶液中，測(cè)定污染物的濃度與生物中毒反應(yīng)之間的關(guān)系，從而確定污染物的毒性；后者把受試生物放于連續(xù)或間歇流動(dòng)的試驗(yàn)溶液中，測(cè)定污染物濃度與生物反應(yīng)之間的關(guān)系。測(cè)試分為短期(不超過96h)的急性毒性試驗(yàn)和長(zhǎng)期(如數(shù)月或數(shù)年)的慢性毒性試驗(yàn)。在一個(gè)試驗(yàn)裝置內(nèi)，測(cè)試生物可以是一種，也可以是多種。測(cè)試工作可在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，也可在野外污染水體中進(jìn)行。

1、水生生物毒性試驗(yàn)

進(jìn)行水生生物毒性試驗(yàn)可用魚類、溞類、藻類等，其中魚類毒性試驗(yàn)應(yīng)用較廣泛。

魚類對(duì)水環(huán)境的變化反應(yīng)十分靈敏，當(dāng)水體中的污染物達(dá)到一定濃度或強(qiáng)度時(shí)，就會(huì)引起系列中毒反應(yīng)。例如：行為異常、生理功能紊亂、組織細(xì)胞病變，直至死亡。魚類毒性試驗(yàn)的主要目的是尋找某種毒物或工業(yè)廢水對(duì)魚類的半數(shù)致死濃度與安全濃度，為制定水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)和廢水排放標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)；測(cè)試水體的污染程度和檢查廢水處理效果等。有時(shí)魚類毒性試驗(yàn)也用于一些特殊目的，如比較不同化學(xué)物質(zhì)毒性的高低，測(cè)試不同種類魚對(duì)毒物的相對(duì)敏感性，測(cè)試環(huán)境因素對(duì)廢水毒性的影響等。下面介紹靜水式魚類急性毒性試驗(yàn)。

（1）供試驗(yàn)魚的選擇和馴養(yǎng)。

金魚來源方便，常用于試驗(yàn)。要選擇無病、活潑、魚鰭完整舒展、食欲和逆水性強(qiáng)、體長(zhǎng)(不包括尾部)約3cm的同種和同齡的金魚。選出的魚必須先在與試驗(yàn)條件相似的生活條件(溫度、水質(zhì)等)下馴養(yǎng)7d以上；試驗(yàn)前一天停止喂食；如果在試驗(yàn)前四天內(nèi)發(fā)生死亡現(xiàn)象或發(fā)病的魚高于10％，則不能使用。

（2）試驗(yàn)條件選擇。

每種濃度的試驗(yàn)溶液為一組，每組至少10條魚。試驗(yàn)容器用容積約10L的玻璃缸，保證每升水中魚質(zhì)量不超過2g。

試驗(yàn)溶液的溫度要適宜，對(duì)冷水魚為12~28℃，對(duì)溫水魚為20～28℃。同一試驗(yàn)中，溫度變化為±2℃；試驗(yàn)溶液中不能含大量耗氧物質(zhì)，要有足夠的溶解氧，對(duì)冷水魚DO≥5mg／L，對(duì)溫水魚DO≥4mg／L；試驗(yàn)溶液的pH應(yīng)為6.7～8.5，試驗(yàn)期間pH波動(dòng)范圍不得超過0.4個(gè)pH單位；硬度影響毒物毒性，一般來說，硬水可降低毒物毒性，而軟水可增強(qiáng)毒物毒性，因此，必須注意檢測(cè)試驗(yàn)溶液的硬度，并在報(bào)告中注明。硬度應(yīng)為50～250mg／L(以CaCO₃計(jì))。

配制試驗(yàn)溶液和馴養(yǎng)魚用的水應(yīng)是未受污染的河水或湖水。如果使用自來水，必須經(jīng)充分曝氣才能使用。不宜使用蒸餾水。

（3）試驗(yàn)步驟。

①預(yù)試驗(yàn)(探索性試驗(yàn))：為保證正式試驗(yàn)順利進(jìn)行，須經(jīng)探索性試驗(yàn)確定試驗(yàn)溶液的濃度范圍，即通過觀察24h(或48h)魚類中毒的反應(yīng)和死亡情況，找出不發(fā)生死亡、全部死亡和部分死亡的濃度。

②試驗(yàn)溶液濃度設(shè)計(jì)：合理設(shè)計(jì)試驗(yàn)溶液濃度，是試驗(yàn)成功的重要保證，通常選7個(gè)濃度(至少5個(gè))，濃度間隔取等對(duì)數(shù)間距，例如：10.0、5.6、3.2、1.8、1.0(對(duì)數(shù)間距0.25)或10.0、7.9、6.3、5.0、4.0、3.6、2.5、2.0、1.6、1.26、1.0(對(duì)數(shù)間距0.1)，其單位可用體積分?jǐn)?shù)(如廢水)或質(zhì)量濃度(mg／L)表示。另設(shè)一對(duì)照組，對(duì)照組在試驗(yàn)期間魚死亡率超過10％，則整個(gè)試驗(yàn)結(jié)果不能采用。

③試驗(yàn)：將試驗(yàn)用魚分別放人盛有不同濃度溶液和對(duì)照水的玻璃缸中，并記錄時(shí)間。前8h要連續(xù)觀察和記錄試驗(yàn)情況，如果正常，繼續(xù)觀察，記錄24h、48h和96h魚的中毒癥狀和死亡情況，供判定毒物或工業(yè)廢水的毒性。

④毒性判定：半數(shù)致死量(LD₅₀)或半數(shù)致死濃度(LC₅₀)是評(píng)價(jià)毒物毒性的主要指標(biāo)之一。

求LC₅₀的簡(jiǎn)便方法是將試驗(yàn)用魚死亡半數(shù)以上和半數(shù)以下的數(shù)據(jù)與相應(yīng)試驗(yàn)溶液毒物(或廢水)濃度繪于半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上(對(duì)數(shù)坐標(biāo)表示毒物濃度，算術(shù)坐標(biāo)表示死亡率)，用直線內(nèi)插法求出。將三種試驗(yàn)時(shí)間試驗(yàn)魚死亡半數(shù)以上和半數(shù)以下最接近半數(shù)的死亡率數(shù)值與相應(yīng)廢水濃度數(shù)值的坐標(biāo)交點(diǎn)標(biāo)出，并分別連接起來，再由50％死亡率處引一橫坐標(biāo)的垂線，與上述三線相交，由三交點(diǎn)分別向縱坐標(biāo)作垂線，垂線與縱坐標(biāo)的交點(diǎn)處濃度即為LC₅₀，可見24h、48h和96h的LC50分別為5.2％、4.7％、4.4％。

⑤魚類毒性試驗(yàn)的應(yīng)用：魚類毒性試驗(yàn)的一個(gè)重要目的是根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)估算毒物的安全濃度，為制定有毒物質(zhì)在水中的最高允許濃度提供依據(jù)。

目前應(yīng)用比較普遍的是最后一種。對(duì)易分解、積累少的化學(xué)物質(zhì)一般選用的系數(shù)為0.05～0.1，對(duì)穩(wěn)定的、能在魚體內(nèi)高積累的化學(xué)物質(zhì)，一般選用的系數(shù)為0.01～0.05。

按公式計(jì)算出安全濃度后，要進(jìn)一步做驗(yàn)證試驗(yàn)，特別是具有揮發(fā)性和不穩(wěn)定性的毒物或廢水，應(yīng)當(dāng)用恒流裝置進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間(如一個(gè)月或幾個(gè)月)的驗(yàn)證試驗(yàn)，并設(shè)對(duì)照組進(jìn)行比較，如發(fā)現(xiàn)有中毒癥狀，則應(yīng)降低毒物或廢水濃度再進(jìn)行試驗(yàn)，直到確認(rèn)某濃度對(duì)魚是安全的，即可定為安全濃度。此外，在驗(yàn)證試驗(yàn)過程中必須投喂餌料。

2、發(fā)光細(xì)菌法

（1）方法原理

發(fā)光細(xì)菌是一類非致病的革蘭氏陰性微生物，它們?cè)谶m當(dāng)?shù)臈l件下能發(fā)射出肉眼可見的藍(lán)綠色光（450~490nm）。當(dāng)樣品毒性組分與發(fā)光細(xì)菌接觸時(shí)，可影響或干擾細(xì)菌的新陳代謝，使細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度下降或不發(fā)光。在一定毒物濃度范圍內(nèi)，有毒物質(zhì)濃度與發(fā)光強(qiáng)度成負(fù)相關(guān)線性關(guān)系，因而可使用生物發(fā)光光度計(jì)測(cè)定水樣的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度來監(jiān)測(cè)有毒物質(zhì)的濃度。

國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 15441——1995）中，以氯化汞作為參比毒性表征廢水或可溶性化學(xué)物質(zhì)的毒性，也可用半數(shù)有效濃度（EC₅₀），即發(fā)光強(qiáng)度為最大發(fā)光強(qiáng)度一半時(shí)的廢水濃度或可溶性化學(xué)物質(zhì)的濃度來表征；選用明亮發(fā)光桿菌T₃亞種作為發(fā)光細(xì)菌。因該菌是一種海洋細(xì)菌，故水樣和參比毒物溶液應(yīng)含有一定濃度的氯化鈉。

目前，常采用新鮮發(fā)光細(xì)菌培養(yǎng)法和冷凍干燥發(fā)光菌粉制劑法。

（2）測(cè)定要點(diǎn)

①試驗(yàn)材料的準(zhǔn)備：專用生物毒性測(cè)試儀，發(fā)光細(xì)菌瓊脂培養(yǎng)液，液體培養(yǎng)基，0.02~0.24mg/L系列HgCl₂標(biāo)準(zhǔn)溶液，新鮮明亮發(fā)光桿菌T₃亞種或明亮發(fā)光桿菌凍干粉，化學(xué)毒物或綜合廢水等。

②新鮮發(fā)光細(xì)菌懸液的制備：從明亮發(fā)光桿菌的菌種斜管面中挑取一環(huán)細(xì)菌接種于新的發(fā)光細(xì)菌瓊脂斜面上，待斜面長(zhǎng)滿菌苔并明顯發(fā)光時(shí)加入適量稀釋液并制成菌懸液；取0.1mL菌懸液接種于50mL液體培養(yǎng)基中，在22℃搖床震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期（12~14h），用稀釋液將菌懸液稀釋成5×10⁷個(gè)（細(xì)胞）/[mL（菌懸液）]，置于4℃下保存?zhèn)溆谩?/SPAN>

③樣品測(cè)定：將過濾去除顆粒物雜質(zhì)的待測(cè)水樣加入占水樣質(zhì)量3％的NaCl，依次加入稀釋液和待測(cè)水樣，恒溫（20±0.5）℃后加入等量發(fā)光細(xì)菌懸液，依次測(cè)其發(fā)光強(qiáng)度。

④測(cè)試結(jié)果分析：根據(jù)測(cè)得的待測(cè)水樣的發(fā)光強(qiáng)度計(jì)算其相對(duì)折光率。

3、致突變和致癌物檢測(cè)

致突變和致癌物也稱誘變劑，其檢測(cè)方法有微核測(cè)定法、艾姆斯(Ames)試驗(yàn)法、染色體畸變?cè)囼?yàn)法等。

微核測(cè)定法原理基于：生物細(xì)胞中的染色體在復(fù)制過程中常會(huì)發(fā)生一些斷裂，在正常情況下，這些斷裂絕大多數(shù)能自行愈合，但如果受到外界誘變劑的作用，就會(huì)產(chǎn)生一些游離染色體斷片，形成包膜，變成大小不等的小球體(微核)，其數(shù)量與外界誘變劑強(qiáng)度成正比，可用于評(píng)價(jià)環(huán)境污染水平和對(duì)生物的危害程度。該方法所用生物材料可以是植物或動(dòng)物組織或細(xì)胞。植物廣泛應(yīng)用紫露草和蠶豆根尖。紫露草以其花粉母細(xì)胞在減數(shù)分裂過程中的染色體作為誘變劑的攻擊目標(biāo)，把四分體中形成的微核數(shù)作為染色體受到損傷的指標(biāo)，評(píng)價(jià)受危害程度。蠶豆根尖細(xì)胞的染色體大，DNA含量多，對(duì)誘變劑反應(yīng)敏感。

Ames試驗(yàn)是利用鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株發(fā)生回復(fù)突變的性能來檢測(cè)被檢物是否具有致突變性。這種菌株均含有控制組氨酸合成的基因，在不含組氨酸的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)，但如果存在致突變物時(shí)，便作用于菌株的DNA，使其特定部位發(fā)生基因突變而回復(fù)為野生型菌株，能在無組氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)�？紤]到許多物質(zhì)是在體內(nèi)經(jīng)代謝活化后才顯示出致突變性的，Ames等人采用了在體外加入哺乳動(dòng)物肝微粒體酶系統(tǒng)(簡(jiǎn)稱s一9混合液)使被檢物活化的方法，提高了試驗(yàn)的可靠性。

色體畸變?cè)囼?yàn)是依據(jù)生物細(xì)胞在誘變劑的作用下，其染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，如染色單體斷裂、染色單體互換等，以此檢測(cè)誘變劑及其強(qiáng)度。

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