質(zhì)譜流式應用于描繪手術(shù)后病人康復的指紋圖譜

在這項研究是基于對32個經(jīng)過髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)的中老年患者血樣進行深入分析后得出的結(jié)論，該成果發(fā)表在今年9月24日發(fā)表的Science Translational Medicine.雜志上。這可能是迄今為止最全面的對于創(chuàng)傷后免疫系統(tǒng)反應特征的研究。

斯坦福大學的研究者能有這一發(fā)現(xiàn)是因為他們使用了一個高度靈敏的技術(shù)——“單細胞質(zhì)譜流式技術(shù)”。這是一種在Garry Nolan（斯坦福大學的微生物學和免疫學教授）的實驗室中發(fā)展起來的新技術(shù)，它利用金屬元素做為抗體的標簽，質(zhì)譜裝置做為檢測手段，可以同時檢測免疫細胞表面以及內(nèi)部的幾十個生化特征，不但可以告訴我們這些細胞屬于什么種類，還可以告訴我們他們的活性如何。

圖二、利用金屬元素作為抗體的標簽，CyTOF2質(zhì)譜流式細胞儀可以對單細胞進行幾十個通道的檢測

第一個24小時的重要線索

“我們了解到，在手術(shù)后的第一個24小時，你會在血液中發(fā)現(xiàn)一些重要線索，這些線索為我們揭示了決定一個病人術(shù)后兩周時狀態(tài)的因素�！盡artin Angst說，他是麻醉學教授、疼痛和手術(shù)期用藥方面的專家，同時也是這項研究的共同通訊作者。

圖三、 Martin Angst教授

這一發(fā)現(xiàn)可能會開創(chuàng)一個新型的個性化診斷方法——只需在術(shù)后檢查病人少量血液樣本，就可以預測他的恢復時間（斯坦福擁有相關(guān)方面的臨時專利）。這種診斷可以幫助醫(yī)生及早決定應該對哪位病人采用更優(yōu)化的恢復方案，幫助病人告訴自己的親人和老板大概的出院時間。充分理解研究中所發(fā)現(xiàn)的分子機制，可能會指導臨床醫(yī)生操縱免疫系統(tǒng)，從而讓病人更快的恢復。

“雖然每年超過2億例的外科手術(shù)中絕大多數(shù)是小手術(shù)，”Angst說“但是，僅在美國，就有數(shù)以百萬計的像髖關(guān)節(jié)置換術(shù)這樣的大創(chuàng)傷手術(shù)，這些手術(shù)會引發(fā)患者顯著的炎癥反應。

愈合與阻礙

“炎癥最初的爆發(fā)階段對愈合過程非常關(guān)鍵，”Angst表示，“你需要釋放這條‘猛龍’，但是你需要能夠駕馭它。太多的炎癥會導致恢復的延遲�！泵庖呦到y(tǒng)的組件必須不斷動態(tài)的調(diào)整自己的功能，以便加速而不是阻礙傷口的愈合。

幾年前，Angst參加了Nolan的一個講座，講座中介紹了質(zhì)譜流式技術(shù)。它可以在單細胞上實現(xiàn)超過50種不同的表面和內(nèi)部蛋白的同時測量，而標準的細胞分選流式通常最多能進行12-15個參數(shù)的測量。這個講座促成了Angst和Nolan之間的合作，博后Brice Gaudilliere成為了他們合作的橋梁，他和Nolan的研究生Gabriela Fragiadakis一起成為本項研究的共同第一作者。

圖四、 Garry Nolan教授

“質(zhì)譜流式一次可以檢測如此多的參數(shù)，這項特殊能力為研究人員提供了一個通向‘細胞靈魂’的窗口，”Nolan說，“我們不僅能識別免疫細胞的身份，還可以觀察它的精神狀態(tài)�！盢olan本人擁有Fluidigm公司的股權(quán)，這家公司生產(chǎn)了本研究中所用的質(zhì)譜流式儀和相關(guān)試劑。

該研究招募了32個沒有其他疾病的患者，年齡大多是在50歲到80歲之間。他們都在斯坦福大學整形外科接受了初次全髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)。研究組采集了他們的術(shù)前1小時、術(shù)后1小時、24小時、72小時以及術(shù)后4～6周的血液樣本。這些樣品在采集后被迅速送到Nolan的實驗室進行質(zhì)譜流式分析。在每個樣本中大概分析了有近50萬個細胞，這些細胞內(nèi)外的35個蛋白的表達量都被精確檢測。這些數(shù)據(jù)不但揭示了每個細胞的身份，還記錄了隱藏在各個細胞內(nèi)部的關(guān)鍵活動。

圖五、質(zhì)譜流式技術(shù)可以實現(xiàn)對免疫細胞的精細分群

在術(shù)后的六周內(nèi)，患者每三天填寫一次問卷調(diào)查，說明自己疼痛和疲勞的程度以及他們新髖關(guān)節(jié)功能恢復情況。

瞄準關(guān)鍵指標

斯坦福研究小組觀察到手術(shù)后有一個“被精確協(xié)調(diào)的、細胞類型和時間特異的免疫反應模式”(Angst語)。該模式包括多種免疫細胞一連串協(xié)同的上升和下降過程，同時伴隨著每種細胞內(nèi)部的各種變化。

“令人驚訝的是，這種手術(shù)后的表型出現(xiàn)在每一例病人中，” Angst說，“只是各類型細胞的數(shù)量和活性變化倍數(shù)各有不同。”

有一個因素比較特別，手術(shù)后24小時與術(shù)后1小時之間，幾個關(guān)鍵作用蛋白在一小群 “首先反應”的免疫細胞中的激活狀態(tài)變化非常關(guān)鍵。這一因素關(guān)系到病人恢復過程中40%～60%的差異。這些“前線細胞”在手術(shù)后不久會顯著增多，但和細胞內(nèi)活動變化不同，其數(shù)量的增加與病人恢復時間的相關(guān)度并不強。

圖六、幾個關(guān)鍵蛋白的激活狀態(tài)和術(shù)后恢復呈現(xiàn)很強的相關(guān)性。

在一個典型健康人血樣中，這群細胞大約只占其白細胞總數(shù)的1～2 %，所以，使用低通量的檢測技術(shù)時，它們內(nèi)部的變化很容易被忽略掉。

這項研究中觀察到的相關(guān)性遠強于以往所有關(guān)于炎癥反應和臨床康復關(guān)系方面的報道。這些研究一般只是監(jiān)測了手術(shù)后不同時間點血液中各種分泌物的水平的變化或者不同細胞的轉(zhuǎn)運情況。但是，這些研究缺乏同時觀察眾多參數(shù)的能力，因此無法知道在特定時間點是哪些免疫細胞正在向血液中分泌這些物質(zhì)，或者此時其他類型的細胞都在干什么。

預測恢復的可能途徑

“如果一個相關(guān)性只能解釋恢復過程中百分之二甚至百分之十的差異，在臨床上是可能不完全的相關(guān)，”Angst說，“而我們確鑿的相關(guān)性則可能產(chǎn)生一個預測術(shù)后恢復的方法，這在臨床中是非常有用的�！�

圖七、利用血液檢查預測術(shù)后恢復的方法有望用于臨床

雖然尚未證實，研究人員相信，這群活動模式與病人恢復過程最為相關(guān)的細胞群，是一個被稱為“髓系抑制性細胞”的亞群，其他的研究顯示它們對炎癥具有抑制作用。這些細胞在癌癥中起到負面作用，它們過度的活動似乎會抑制身體的免疫系統(tǒng)攻擊腫瘤。但在手術(shù)后的背景下，他們的活動可能就是醫(yī)生所希望的。