實(shí)驗(yàn)室設(shè)備注意事項(xiàng)

隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展,生物活性物質(zhì)不斷被利用,利用轉(zhuǎn)基因的宿主體(原核和真核)細(xì)胞生產(chǎn)的活性物質(zhì)作為藥物已應(yīng)用于臨床,國(guó)內(nèi)外批準(zhǔn)上市的已逾50種,正在開(kāi)發(fā)的數(shù)量達(dá)幾百種其中,大部分是蛋白質(zhì)和活性多肽蛋白質(zhì)分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)決定其活性影響活性的因素很多,主要有兩方面,一是結(jié)構(gòu)因素,包括分子量大小,氨基酸組成,氨基酸序列,有無(wú)二硫鍵,二硫鍵位置,空間結(jié)構(gòu);二是蛋白質(zhì)分子周圍的環(huán)境因素,蛋白質(zhì)!多肽受復(fù)雜的物理!化學(xué)因素影響而產(chǎn)生凝聚!沉淀!水解!脫酰氨基等變化國(guó)內(nèi)已批準(zhǔn)上市的基因工程藥物和疫苗有20多種,大部分是凍干制劑,原因就是凍干制劑能長(zhǎng)期保持蛋白質(zhì)!多肽的活性因此,在新藥的研發(fā)過(guò)程中,凍干技術(shù)是重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。

在加入WTO后,全球一體化,市場(chǎng)開(kāi)放,藥物二次加工市場(chǎng)發(fā)展迅速,藥物外包加工(Outsourcing)早已成為歐美制藥工業(yè)的一種慣例據(jù)報(bào)道,2003年全球藥物外包市場(chǎng)達(dá)300億美元,2004年估計(jì)達(dá)340~350億美元制劑外包約占整個(gè)藥物外包市場(chǎng)的26%,其余為原料藥外包加工20世紀(jì)90年代后,委托加工原料藥(訂單加工原料藥)已被技術(shù)要求更高的/提高原料藥的加工檔次0所代替,即大公司將其開(kāi)發(fā)的新藥(原料藥)交給具有很強(qiáng)科技實(shí)力的科研開(kāi)發(fā)型公司,由后者將新藥(尤其是蛋白質(zhì)/多肽類藥以及抗病毒藥!抗癌藥等等)加工成適合作為納米級(jí)制劑!凍干粉針!口腔快溶片!氣霧/干粉吸入劑,以及其他新穎給藥途徑的原料藥這一方式成為/藥物二次加工的新目標(biāo)凍干針劑是其中一項(xiàng)重要的技術(shù)產(chǎn)品,如荷蘭的DSM公司,它是歐洲著名的藥物二次加工大企業(yè),擅長(zhǎng)加工抗生素原料藥的凍干粉針劑2004年,投資6200萬(wàn)美元擴(kuò)大凍干粉針劑生產(chǎn)能力(11臺(tái)超大型凍干機(jī),每臺(tái)占地30多m2),成為歐洲最大的粉針劑生產(chǎn)公司加拿大的PATHEON公司是北美主要的藥物二次加工企業(yè),主營(yíng)代加工凍干粉針劑該公司與意大利合作在意大利建立一個(gè)大型的凍干粉針劑生產(chǎn)基地,一臺(tái)大型凍干裝置占地271m2，可見(jiàn)凍干技術(shù)不但作為基因工程藥物生產(chǎn)的一個(gè)重要環(huán)節(jié),而且其技術(shù)的優(yōu)勢(shì)可以發(fā)展成為一個(gè)產(chǎn)業(yè)。

本文將結(jié)合基因工程的多肽和蛋白質(zhì)藥物的凍干針劑生產(chǎn),結(jié)合本中心的中試工作,進(jìn)行討論,供同行參考。

1 冷凍干燥技術(shù)的原理和應(yīng)用

（1） 原 理

冷凍干燥是指將藥品在低溫下凍結(jié),然后在真空條件下升華干燥,去除冰晶,待升華結(jié)束后再進(jìn)行解吸干燥,除去部分結(jié)合水的干燥方法該過(guò)程主要可分為藥品準(zhǔn)備!預(yù)凍!一次干燥(升華干燥)!二次干燥(解吸干燥)!密封保存等步驟圖1所示縱坐標(biāo)為氣壓,橫坐標(biāo)為溫度,0℃(實(shí)際為0.001℃)為三相點(diǎn),表示水以液體存在時(shí)的最低大氣壓,低于該點(diǎn)氣壓,水只能以冰或蒸氣存在,也就是在此時(shí)升溫時(shí),水只能從冰直接變成蒸氣,冷凍干燥就是遠(yuǎn)低于該氣壓(高真空度)下干燥水分的,通常在66~133Pa真空度和-25℃以下,才能保證冷凍干燥順利進(jìn)行。
（2） 優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)

冷凍干燥與其他干燥方法相比,有以下優(yōu)點(diǎn):

1)藥液在凍干前分裝,分裝方便!準(zhǔn)確!可實(shí)現(xiàn)連續(xù)化;

2)處理?xiàng)l件溫和,在低溫低壓下干燥,有利于熱敏物質(zhì)保持活性,可避免高溫高壓下的分解變性,以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)不會(huì)變性;

3)含水量低,凍干產(chǎn)品含水量一般在1%~3%,同時(shí)在真空,甚至可在通N2保護(hù)情況下干燥和保存,產(chǎn)品不易被氧化,有利于長(zhǎng)途運(yùn)輸和長(zhǎng)期保存;

4)產(chǎn)品外觀優(yōu)良,為多孔疏松結(jié)構(gòu)且顏色基本不變,復(fù)水性好,凍干藥品能迅速吸水還原成凍干前狀態(tài);

5)凍干設(shè)備封閉操作,安裝環(huán)境潔凈度高,減少雜菌和微粒的污染,干燥中和封裝后的缺氧可起到滅菌和抑制某些細(xì)菌活力的作用

冷凍干燥及制品的缺點(diǎn)和不足:

1)設(shè)備要求高!投資大!干燥速率低!干燥時(shí)間長(zhǎng)!能耗高;

2)生物活性物質(zhì)(如多肽和蛋白質(zhì)藥物)采用凍干制劑主要是為了保持活性,但配料(如保護(hù)劑!溶劑!緩沖劑等)選擇不合理!工藝操作不合理!凍[XW:PAGE]干設(shè)備選擇不適當(dāng)都可能在凍干制劑制備過(guò)程中失活,導(dǎo)致產(chǎn)品前功盡棄,這是生產(chǎn)凍干制劑的關(guān)鍵,需進(jìn)行基礎(chǔ)研究和針對(duì)特定產(chǎn)品反復(fù)試驗(yàn);

3)溶劑不能隨意選擇,只限于水或一些冰點(diǎn)較高的有機(jī)溶劑,所以很難制備某種特殊的晶型,有時(shí)凍干品在復(fù)水溶解時(shí)會(huì)出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象,這些均為開(kāi)發(fā)凍干制劑所必須考慮和實(shí)驗(yàn)研究的。
（3） 冷凍干燥技術(shù)的應(yīng)用

冷凍干燥技術(shù)于1813年英國(guó)人Wallaston發(fā)明,1909年Shsckell試驗(yàn)用該方法對(duì)抗毒素!菌種!狂犬病毒及其他生物制品進(jìn)行凍干保存,取得了較好的效果在第二次世界大戰(zhàn)中由于對(duì)血液制品的大量需求,冷凍干燥技術(shù)得到了迅速發(fā)展,進(jìn)入了工業(yè)應(yīng)用階段。50年代凍干食品系統(tǒng)的大規(guī)模發(fā)展,促進(jìn)了凍干技術(shù)和設(shè)備的進(jìn)步,但由于高難度!高投入!高能耗和制造設(shè)備的落后,經(jīng)歷了幾十年的起伏和徘徊。近20多年來(lái),隨著人們生活水平提高,對(duì)食品的品質(zhì)!營(yíng)養(yǎng)!天然無(wú)公害的觀念轉(zhuǎn)變,推動(dòng)了凍干技術(shù)的發(fā)展,生產(chǎn)過(guò)程從間歇式到連續(xù)式,設(shè)備從0.1m2到上千m2形成系列,應(yīng)用范圍廣泛:在科研方面,應(yīng)用于如分析土壤中的衡量成分;去除高效液相色譜收集組分的溶劑;考古中發(fā)現(xiàn)的重要文物如布匹!皮革!竹簡(jiǎn)等的干燥脫水等在工業(yè)上,應(yīng)用于凍干食品如蔬菜!水果!海產(chǎn)品!甚至鮮花等;香料及調(diào)味品如咖啡!茶及各種香料!調(diào)味料;保存營(yíng)養(yǎng)保健成分及色香味形的方便食品(日本方便食品中50%是凍干食品);水產(chǎn)品最廣泛!要求最嚴(yán)格的還是在醫(yī)藥和生物制品方面的應(yīng)用,主要是應(yīng)用于血清!菌種!基因工程藥物!疫苗!天然藥物及生物制品等我國(guó)生物制品規(guī)程2000版中,確定的11個(gè)重組治療蛋白藥物就有8個(gè)是凍干制劑,如重組人干擾素α1b!重組人干擾素α2b!重組人干擾素α2b!重組人干擾素γ!重組人白介素22!重組人紅細(xì)胞生成素!重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子!重組鏈激酶。

冷干制劑的生產(chǎn)過(guò)程

基因工程多肽和蛋白質(zhì)藥物凍干制劑是通過(guò)宿主體(微生物或動(dòng)物細(xì)胞)培養(yǎng)獲得表達(dá)產(chǎn)品!經(jīng)分離純化得到活性物質(zhì),經(jīng)過(guò)配制!過(guò)濾與分裝,分裝好的樣品送入冷凍干燥機(jī),進(jìn)行預(yù)凍!升華!干燥,最后封口因此凍干制劑的生產(chǎn)過(guò)程包括藥物準(zhǔn)備!預(yù)凍!一次干燥(升華干燥)和二次干燥(解吸干燥)!密封保存等5個(gè)步驟。以下將詳細(xì)說(shuō)明。

對(duì)于新產(chǎn)品的開(kāi)發(fā),則必須通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定凍干的工藝條件,在藥物準(zhǔn)備好后,要確定藥物水溶液的共熔點(diǎn),共熔點(diǎn)對(duì)冷凍干燥很重要,因?yàn)樗幰菏且粋�(gè)復(fù)雜的液體,當(dāng)溫度下降到某一溫度時(shí)晶體開(kāi)始析出,隨溫度下降,晶體數(shù)量增加,到最后才全部凝結(jié),此時(shí)溫度叫共凝點(diǎn),若從冷凍狀態(tài)升溫到共凝點(diǎn),融化開(kāi)始,這就溶質(zhì)和溶劑的共熔點(diǎn)。不同物質(zhì)的共熔點(diǎn)不同,如0.85%氯化鈉溶液為-21.2℃,而10%葡萄糖溶液為-27℃共熔點(diǎn)的測(cè)量有熱分析法!電阻法和低溫顯微鏡直接觀察等方法。熱分析法是基于凍結(jié)的藥品在升溫過(guò)程中,溫度達(dá)到共熔點(diǎn)時(shí)會(huì)突然有個(gè)能量的吸收,用熱分析儀來(lái)測(cè)定該能量吸收峰可計(jì)算得到共熔點(diǎn)溫度;電阻法是在降溫冷凍或先冷凍后升溫過(guò)程中電阻突然變大或變小求得,對(duì)非離子型有機(jī)化合物其電阻變化不明顯,可加入一定量的附加劑來(lái)測(cè)定冷凍干燥是在真空狀態(tài)下進(jìn)行,只有藥液全部?jī)鼋Y(jié)后才能在真空下升華,否則部分液體存在時(shí),在真空下不僅會(huì)迅速蒸發(fā),造成液體的濃縮,使凍干產(chǎn)品萎縮,而且溶解在水中的氣體在真空下會(huì)迅速冒出來(lái),造成液體沸騰,甚至冒出凍干瓶外,所以凍干產(chǎn)品在開(kāi)始升華時(shí)的溫度必須低于共熔點(diǎn),全部?jī)鼋Y(jié)。

冷凍干燥時(shí)間一般較長(zhǎng),為保證產(chǎn)品質(zhì)量和縮短生產(chǎn)周期,必需通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)來(lái)確定凍干曲線,因?yàn)閮龈尚Ч�是以凍干制劑與原藥液的活性保存率來(lái)衡量,而活性保存率既與凍干曲線有關(guān),亦與藥液的組成與配比有關(guān),因此需多次反復(fù)試驗(yàn)才能進(jìn)行優(yōu)化與確定。