FLIPRTETRA系統(tǒng)檢測細胞內(nèi)PH值變化的實驗方案

FLIPR^TETRA系統(tǒng)檢測細胞內(nèi)PH值變化的實驗方案

簡介

FLIPR^TETRA系統(tǒng)可用于完成多數(shù)細胞基礎(chǔ)的實驗研究。本篇應(yīng)用研究推薦了細胞內(nèi)pH值檢測實驗在FLIPR上運行的基礎(chǔ)方案。實驗在貼壁細胞上完成，同時還討論了一些重要參數(shù)的優(yōu)化。因為每種細胞系都有其獨有的特性，每個研究人員在進行自己的實驗時都需要進行單獨的優(yōu)化。

細胞內(nèi) pH 實驗的原理

Na⁺/H⁺ exchanger（NHE）排出氫離子同時泵入鈉離子，以維持pH穩(wěn)定性。BCECF是pH敏感的染料，其在堿性條件下吸光度更高，反之酸性條件下變低。從而BCECF可被用于監(jiān)測細胞內(nèi)pH變化進而反應(yīng)NHE活性。加入BCECF孵育細胞，之后加入NH₄Cl，NH₄Cl有助于促進染料進入細胞內(nèi)，且NH₃會造成堿性環(huán)境（高熒光信號）。當NH₄Cl被FLIPR加入的溶液稀釋后，NH₃擴散出細胞，導致細胞內(nèi)H⁺濃度升高，進而引起熒光信號的快速下降。這些H⁺將會被NHE泵出細胞（熒光信號的緩慢升高與NHE活性是相對對應(yīng)的）。

細胞準備

實驗前一天細胞種在多孔板中，之后的所有步驟均在96孔板或384孔板中完成。具體操作步驟如下：

1. 在96或384孔板中種上細胞

2. 加載BCECF至細胞中孵育45分鐘

3. 加入20 mM NH₄Cl至細胞板中以酸化細胞，孵育15分鐘

4. 用含20 mM NH₄Cl的緩沖液清洗細胞

5, 用FLIPR進行檢測；NH₄Cl緩沖液用大體積的平衡鹽溶液和各種配體/對照品進行稀釋。

優(yōu)化細胞種板的密度是很有必要的，保證了過夜培養(yǎng)后每孔可以形成密度相似的均一單細胞層。通過適當?shù)恼{(diào)整種板時的密度，細胞可以培養(yǎng)超過一天來達到實驗當天的要求。粘附性弱或生長不規(guī)則的細胞需要在用多聚賴氨酸、層黏蛋白或膠原蛋白包被過的多孔板中培養(yǎng)。

染料加載

為了觀察細胞內(nèi)PH值變化，需要在細胞中加載pH敏感的熒光染料。不同的細胞類型其染料加載方案需要進行優(yōu)化。

熒光染料

迄今為止，BCECF是最廣泛用于細胞內(nèi)pH值檢測實驗的熒光染料試劑。

陰離子交換蛋白抑制劑

一些類型的細胞通過陰離子交換蛋白轉(zhuǎn)移陰離子至細胞外，這些陰離子包含了熒光染料。這樣不僅僅導致了染料加載效果的減弱，同時導致了最終數(shù)據(jù)結(jié)果的誤差；當待檢測的化合物被添加后會由于細胞外染料被稀釋引起記錄的熒光信號值急劇地下降。（待檢測化合物用不含染料的緩沖液稀釋）因而，抑制陰離子交換蛋白活性是FLIPR能否成功檢測的關(guān)鍵所在。

丙磺舒是一種陰離子交換蛋白抑制劑，被加入到加載培養(yǎng)基中后可以增加染料保留在細胞內(nèi)的比例。已知的一個需要丙磺舒的細胞類型是CHO。盡管丙磺舒可以延緩染料從細胞內(nèi)被轉(zhuǎn)移至胞外，但其對細胞來說有一定的毒性，因此染料加載后的孵育時間應(yīng)盡可能控制在最短時間內(nèi)。 .

苯磺唑酮是另一種陰離子交換蛋白抑制劑。至今，在細胞內(nèi)pH值檢測實驗中很少有使用到苯磺唑酮的信息。

用于染料加載的培養(yǎng)基

測試了幾種類型的染料加載培養(yǎng)。最佳的培養(yǎng)基應(yīng)能兼顧兩方面——染料加載和良好的細胞反應(yīng)。可能的選擇有：

1. 生長培養(yǎng)基+10% 胎牛血清(FBS) + 20 mM HEPES

2. 生長培養(yǎng)基+1% FBS + 20 mM HEPES

3.  Hank’s BSS 1X（不含丙磺舒）+ 20 mM HEPES +1% FBS

4.  Hank’s BSS 1X（不含丙磺舒）+ 20 mM HEPES +1% BSA

• 染料加載后的孵育時間和溫度

最佳的孵育時間取決于細胞類型。由于熒光染料對細胞是有毒的，所以要嚴格控制孵育時間。60分鐘、37°C是通常對大多數(shù)細胞都有效的孵育條件，一般也作為方法開發(fā)時的起始推薦條件。

注：如果孵育30分鐘可以得到一個可接受的熒光信號，建議采用更短時間的孵育條件。

細胞中酸性溶液的加載 細胞中酸性溶液的加載

這個步驟不是直接加入酸本身，而是向細胞中加入NH₄Cl。當NH4Cl在細胞中形成NH₃并使細胞質(zhì)堿化，隨后當NH₄Cl被FLIPR系統(tǒng)添加的溶液稀釋后，NH₃擴散至細胞外使得細胞內(nèi)殘留高濃度的H⁺。這將激發(fā)NHE的活性并把氫離子排出至細胞外。

用于此步的溶液是200 mM NH₄Cl。NH₄Cl一直保留在多孔板中，直至FLIPR添加溶液使其被稀釋。

化合物板準備

在本次實驗中，由于染料加載后孵育的時間足夠長，便于準備所需的化合物板。

準備化合物稀釋緩沖液

在細胞內(nèi)pH檢測實驗中，用于稀釋化合物的緩沖液以及清洗細胞的緩沖液是不同的（與細胞內(nèi)鈣流及膜電位實驗相比）。清洗緩沖液含有20 mM NH4Cl，而化合物稀釋緩沖液不含NH4Cl。待檢測化合物應(yīng)稀釋至實驗時終濃度的1.25倍。

細胞清洗

染料加載后并添加了NH₄Cl溶液，需要用清洗緩沖液清洗幾次以去除細胞外的染料。所有清洗步驟中均需含有20 mM NH₄Cl。建議使用Molecular Devices公司的洗板機，適用于96孔或384孔板，可調(diào)節(jié)高度和速率。

從FLIPR系統(tǒng)得到的高質(zhì)量數(shù)據(jù)一部分取決于細胞清洗環(huán)節(jié)的洗板機性能，是否可以保證最后一次清洗結(jié)束后每個孔中剩余的體積是一致的。手動清洗后得到的結(jié)果差異性更大。另外，如果手動清洗切記注意不要在兩次清洗步驟之間吸干孔中溶液使得細胞直接暴露在空氣中。

注: 清洗緩沖液和稀釋化合物的緩沖液是不一樣的。

運行實驗

實驗前一天將細胞種在 實驗前一天將細胞種在 實驗前一天將細胞種在 實驗前一天將細胞種在 實驗前一天將細胞種在 相應(yīng)的黑壁 相應(yīng)的黑壁 相應(yīng)的黑壁 96 或 384孔細胞板上 ：

1） 加入 BCECF，孵育 45 分鐘

2） 加入 20mM NH ₄Cl ，孵育 ，孵育 15 分鐘

3） 用含 20mM NH₄Cl 的緩沖液清洗細胞

4） 開始實驗

儀器設(shè)置

下表中FLIPR系統(tǒng)設(shè)置的參數(shù)適用于所有CHO細胞的BCECF實驗。