利用iPSC衍生的肝細胞進行多參數(shù)高內(nèi)涵肝細胞毒性檢測

 

 

藥物引發(fā)的肝毒性是造成肝損傷和急性肝衰竭的重要原因之一。因此如何高效的檢測藥物的有效性和安全性對于促進藥物研發(fā)和減少藥物消耗至關(guān)重要。人誘導(dǎo)的多功能干細胞(iPSC)衍生的肝細胞具有典型的成熟細胞的特征和代謝形式，這對于我們用高內(nèi)涵篩選藥物是非常理想的。

雖然對于如何利用高內(nèi)涵進行藥物篩選已經(jīng)有了很多標準的程序，但是對于如何通過圖像分析評估不同毒性卻仍然非常復(fù)雜且大多依靠經(jīng)驗。本文中我們闡述了如何利用ImageXpress® Micro XL系統(tǒng)對多參數(shù)肝毒性進行分析。每一個孔或者細胞都會產(chǎn)生多種化合物誘導(dǎo)的細胞反應(yīng)，而這些反應(yīng)可以用MetaXpress® 5軟件的自定義模塊進行分析。

 

活性染色(例如Calcein AM)可以用來粗略的檢測活細胞中的化合物毒性。首先用各種化合物對肝細胞進行72小時處理并染色。通過ImageXpress Micro XL 系統(tǒng)的10倍物鏡我們可以得到肝細胞的圖像， 然后我們用MetaXpress軟件的Multi-Wavelength Cell Scoring應(yīng)用模塊對活細胞的整個核區(qū)域(Hoechst復(fù)染色)和細胞質(zhì)區(qū)域(Calcein AM)進行分析(圖1)。

 

 

 

線粒體去極化是缺氧損傷和氧化應(yīng)激的早期標志。我們可以用JC-10對線粒體膜電位進行檢測，雖然橙色的J-aggregates肉眼可見，但是對于膜去極化來說，這種染料可以進入到細胞質(zhì)中并發(fā)出特定的熒光波長。在用ImageXpress Micro XL系統(tǒng)成像前先用化合物處理肝細胞60分鐘并用JC-10染色。系統(tǒng)的自定義模塊可以對健康線粒體中保存的染料和滲透到細胞質(zhì)中的染料分別定量。通過分析這兩類熒光染色信號強度的比率我們可以得到比之前單一檢測更可靠的數(shù)據(jù)(圖2)。

 

 

 

一些藥物會引起磷脂質(zhì)病和脂肪變性，這是由脂肪代謝紊亂引起的組織中過多的磷脂質(zhì)和中性脂肪聚集造成的。我們可以用成像的方法對肝細胞中的磷脂質(zhì)和中性脂肪的分布進行檢測，這一檢測可以精確到單細胞水平。圖3我們列舉的實驗中肝細胞被種在384孔板24小時后，用待測化合物處理孵育了4天。

 

 

 

MetaXpress軟件中的自定義模塊編輯器可以讓科學(xué)家們針對自己感興趣的參數(shù)進行復(fù)雜的分析。這種自定義模塊已被證明可以有效的定量細胞大小，形狀，不同細胞的總數(shù)以及凋亡情況(圖4)。這些模塊也可以應(yīng)用在圖像處理上，還可以用MetaXpress.PowerCore. High Content Distributed Image Analysis Software對大量樣本進行高通量篩選分析。

 

 

多參數(shù)圖像分析可以顯著的提高分析的靈敏性，并且為我們進一步了解化合物毒性發(fā)生機制提供更多信息。利用MetaXpress 5軟件的自定義模塊編輯器，科學(xué)家們可以自由的設(shè)計和調(diào)整圖像分析模塊并迅速的對毒性進行分析及得到相應(yīng)結(jié)果。Molecular Devices®為評估肝細胞毒性提供了非常人性化的高內(nèi)涵篩選方法，這種方法大大領(lǐng)先于傳統(tǒng)的非死即活的簡單檢測。