貼壁CHOMito-Photina®/H3發(fā)光蛋白細(xì)胞在FLIPRTETRA系統(tǒng)中的化學(xué)發(fā)光細(xì)胞實驗

 

對于藥物研發(fā)早期先導(dǎo)化合物尋找和確認(rèn)，配有發(fā)光蛋白檢測應(yīng)用的FLIPRTETR是簡便且可信賴的高通量篩選系統(tǒng)。發(fā)光蛋白檢測部件包含了增強型CCD (ICCD) 相機和懸浮細(xì)胞系統(tǒng)。ICCD相機的增益可調(diào)節(jié)功能使得FLIPR^TETRA系統(tǒng)既可以適應(yīng)基于染料的明亮的熒光實驗，也可以記錄信號強度較弱的化學(xué)發(fā)光蛋白實驗。本篇應(yīng)用文章描述了貼壁CHO Mito-Photina®/H3發(fā)光蛋白細(xì)胞在FLIPRTETRA系統(tǒng)中的實驗結(jié)果和表現(xiàn)。

 

CHO mito-Photina/H3是由Axxam SPA (Milan, Italy)提供的細(xì)胞系，表達(dá)了線粒體靶點去輔基發(fā)光蛋白和 G蛋白偶聯(lián)受體組胺3 (H3)，連同了Gαq蛋白。與腔腸素孵育時，Apo- Photina在細(xì)胞中表達(dá)形成了一個激活的Photina 分子，其在結(jié)合GPCR被激活引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子流后可以發(fā)射出藍(lán)色光。 化學(xué)發(fā)光檢測型 ICCD 相機可輕易地檢測出Photina細(xì)胞發(fā)出的高相關(guān)光單位 (RLU)信號，無需相機飽和。使用相機的增益可調(diào)節(jié)功能使得FLIPR^TETRA系統(tǒng)同樣可以檢測很低的光信號并且在化學(xué)發(fā)光實驗中所需細(xì)胞數(shù)量較少，減少了細(xì)胞培養(yǎng)方面的需求。

 

培養(yǎng)基：Dulbecco’s MEM/ 營養(yǎng)素混合F-12并添加了HEPES (Cat. #11039-047), 1.35 mM 丙酮酸鈉 (Cat. #11360- 070), 10% FBS (Cat. #10082-147), 1%青霉素/鏈霉素(Cat. #15070-063)。500 μg/mL遺傳霉素(Cat.#10131-027)。1% L-谷胱甘肽 (Cat. #25030-081), 均來自Invitrogen公司。

Versene (Invitrogen Cat. #15040-066)

不含鈣鎂離子的PBS (Invitrogen Cat. #14190 或類似溶液)

 0.05% 含EDTA的Trypsin (Invitrogen Cat.#25300-054)

天然的腔腸素（細(xì)胞提供者建議）

BSA Media: DMEM/F12 （不含酚紅），含15 mM HEPES (Invitrogen Cat.#11039-021)，0.1% BSA (Fraction V heat shocked, low endotoxin, low protease (Sigma Cat. #A6003 或類似物)  Water for injection (Irvine Scientific Cat.#9309 or equivalent)

 Tyrode Buffer (pH7.4)—alternate for BSA Media (all chemicals from Sigma): 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM

384-well 黑壁底透記錄板（Corning Cat. #3172 or equivalent)

 

發(fā)光蛋白的化學(xué)發(fā)光實驗中涉及到細(xì)胞、化合物和儀器的準(zhǔn)備。儀器設(shè)置在表1、2、3中有相應(yīng)的描述。更多的信息可以參照FLIPR_TETRA系統(tǒng)使用說明書中化學(xué)發(fā)光實驗方案的7.13章節(jié)。

 

第一步：實驗前，復(fù)蘇細(xì)胞并在篩選抗生素條件下培養(yǎng)，遵照細(xì)胞提供者的指導(dǎo)方案操作。

第二步：開始實驗前的一天用trypsin從flask中消化細(xì)胞

第三步：在無抗生素的培養(yǎng)基中，按照每孔2500-10000個細(xì)胞在384孔黑壁底透的記錄板上種上細(xì)胞。37°C 和5% CO₂過夜培養(yǎng)。

第四步：實驗當(dāng)天上午，去除記錄板孔中的培養(yǎng)基。

第五步：在光照強度弱的環(huán)境中，每孔中加入25 μL BSA培養(yǎng)基或含有5 μM 天然腔腸素的替代培養(yǎng)基。

第六步：蓋上板蓋，然后包上錫箔紙以避光，然后在22℃或更低溫度孵育4-6小時以優(yōu)化腔腸素反應(yīng)。

 

化合物板能包含足夠的體積滿足3-4個記錄板的需求。準(zhǔn)備384孔的聚丙烯化合物板并預(yù)留足夠的體積避免向細(xì)胞板移液時產(chǎn)生氣泡。

 

 

 

 

 

 

第一步：加載384孔黑色FLIPRTETRA系統(tǒng)槍頭

第二步：在ScreenWorks®軟件中創(chuàng)建一個FLIPRTETRA系統(tǒng)實驗方案。 相機和記錄參數(shù)設(shè)置見表1。移液和加樣參數(shù)見表2和3。在本次實驗中未使用懸浮細(xì)胞裝置。移液加樣過程中的維持和排空體積設(shè)置可能會產(chǎn)生氣泡，引起信號誤差。更新軟件設(shè)置之前保存文件。

第三步：確保腔腸素加入至細(xì)胞板并避光。選擇下列合適的方法來完成您的實驗。

這里列出了三種不同過程的實驗方案：

 

第四步： 加入25 μL 2X 激動劑至細(xì)胞板中，然后記錄數(shù)據(jù)30-60秒。

 

或者

第四步： 加入25 μL 2X 抑制劑至細(xì)胞板并記錄數(shù)據(jù)。

第五步： 避光孵育細(xì)胞板15-30分鐘。

第六步： 加入25 μL 3X 激動劑至細(xì)胞板并記錄數(shù)據(jù)

 

或者

第四步： 實驗前先加入抑制劑至細(xì)胞板并孵育是可接受的。

第五步： 避光孵育細(xì)胞板15-30分鐘。

第六步：加入25 µL 3X 激動劑至細(xì)胞板并記錄數(shù)據(jù)。

 

圖1所示的RLU 信號的數(shù)據(jù)簡化是在ScreenWorks軟件中根據(jù)信號的反應(yīng)/背景進(jìn)行計算的。圖2所示的RLU 信號簡化是在ScreenWorks軟件中根據(jù)信號的最大值—最小值進(jìn)行計算的。量效曲線是采用GraphPad Prism® 3軟件進(jìn)行計算的。

 

在本次實驗中，采用細(xì)胞數(shù)梯度減少來決定實驗的檢測范圍。細(xì)胞在37°C和5%CO₂條件下過夜培養(yǎng)使其在實驗前充分貼壁。配有化學(xué)發(fā)光檢測部件的FLIPRTETRA 系統(tǒng)在記錄時添加激動劑至貼壁細(xì)胞。RLU值既可以用于最大值減去最小值的計算也可以用于效應(yīng)相對于背景信號的計算。根據(jù)實驗中每孔1250個細(xì)胞計算的EC₅₀值與每孔10000個細(xì)胞的結(jié)果是類似的。圖1顯示了隨著細(xì)胞數(shù)量增加信號窗口的增加。在每孔2500個細(xì)胞時，信號窗口大約是300:1，與之相比較FLIPR® Calcium 4 Assay Kit熒光信號窗口大約是4：1（數(shù)據(jù)未列出）。之后的貼壁細(xì)胞實驗采用每孔2500個細(xì)胞來完成，過夜種板培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞Photina 實驗可以在中低細(xì)胞密度下完成，并且在EC₈₀ 篩選濃度下得到很好的Z值。圖1所示信號效應(yīng)是按照反應(yīng)/背景來計算的。

 

在圖2 所示的實驗中，在優(yōu)化好的細(xì)胞濃度條件下比較了激動劑效應(yīng)和抑制劑效應(yīng)。384 孔黑壁底透的細(xì)胞板每孔中種下2500 個CHO mito-Photina/H3 細(xì)胞并在37°C 和5% CO₂ 下過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)基去除后，在實驗緩沖液中加入5 μM 天然腔腸素并避光孵育四小時。

 

在本實驗中，數(shù)據(jù)簡化結(jié)果是按照記錄階段最大值減去最小值來計算的。激動劑的EC₅₀ 和抑制劑IC₅₀ 值與文獻(xiàn)報道的數(shù)值是一致的。

 

 

 

 

 

 

配有化學(xué)發(fā)光檢測部件的FLIPR^TETRA 系統(tǒng)表現(xiàn)出更卓越的信號檢測能力。不僅表現(xiàn)在一個相機可以檢測熒光和化學(xué)發(fā)光，而且相機的增益可調(diào)節(jié)，從而在化學(xué)發(fā)光檢測時可達(dá)到無與倫比的動態(tài)范圍。在進(jìn)行化學(xué)發(fā)光高通量篩選實驗中系統(tǒng)是被證明很有用途的。在配有化學(xué)發(fā)光檢測部件的FLIPR^TETRA 系統(tǒng)中基于發(fā)光蛋白的鈣流實驗具有以下優(yōu)點：

 

Ø 系統(tǒng)無與倫比的動態(tài)范圍可以檢測從極亮至昏暗的所有光信號。

Ø 更低的背景噪音，更高的信噪比和更大信號窗口

Ø 更低的細(xì)胞數(shù)量，減少細(xì)胞培養(yǎng)工作量

Ø 實驗更靈活，貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞均可進(jìn)行實驗

Ø 可超過6 小時的長時間持續(xù)實驗

Ø 無論是激活還是抑制實驗均可以得到與文獻(xiàn)報道高度一致性的數(shù)據(jù)結(jié)果

Ø 消除了化合物自發(fā)熒光對結(jié)果的干擾

Ø 更低的試劑耗費

 

S. Bovolenta, M. Foti, Lohmer, S., S. Corazza. Development of a Ca2+-Activated Photoprotein, Photina, and Its Application to High-Throughput Screening. J Biomol Screen 2007; Vol. 12(5) 694–704.