量化成像流式細(xì)胞技術(shù)在心血管研究中的應(yīng)用

“我國每5個(gè)成年人中就有1個(gè)心血管病患者，每10秒鐘就有1人死于心血管疾病“，心血管疾病在致中國城鎮(zhèn)與農(nóng)村居民死亡疾病中占首位。因此可見，心血管疾病的預(yù)防與治療是未來臨床與科研重點(diǎn)關(guān)注的研究方向。轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)這一概念的提出促進(jìn)了臨床實(shí)踐向基礎(chǔ)研究提出新的命題，基礎(chǔ)研究提出可能的解決方案進(jìn)行臨床驗(yàn)證，相互轉(zhuǎn)化。目前中國轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的研究重點(diǎn)在心血管疾病與腫瘤，集中在疾病的發(fā)病機(jī)制、疾病的早期非創(chuàng)傷性診斷、疾病的規(guī)范治療及新藥物新技術(shù)的開發(fā)等。細(xì)胞水平建立體外疾病模型從而研究相關(guān)發(fā)病機(jī)制與治療手段，是心血管疾病關(guān)注的重要方向。流式細(xì)胞檢測(cè)和顯微成像，是細(xì)胞水平研究的兩大傳統(tǒng)方法。利用流式細(xì)胞技術(shù)，科研人員可以分析上萬個(gè)細(xì)胞，獲得每個(gè)細(xì)胞的相對(duì)大小、顆粒度和熒光信號(hào)的數(shù)值，從而得到細(xì)胞群體的各種統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，篩選出稀有的細(xì)胞亞群。但是傳統(tǒng)流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)存在一定局限，獲得高通量的同時(shí)忽略了細(xì)胞承載的豐富信息。研究人員僅僅得到散點(diǎn)圖上的一個(gè)點(diǎn)，而不是真實(shí)的細(xì)胞圖像，缺乏細(xì)胞形態(tài)、亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)與熒光信號(hào)空間分布的相關(guān)信息。要想獲得基于細(xì)胞圖像的數(shù)據(jù)，研究人員必須借助各種顯微成像設(shè)備進(jìn)行觀察，但顯微鏡能夠觀察到的細(xì)胞數(shù)量是非常有限的，容易遺漏稀少事件，手動(dòng)分析數(shù)據(jù)耗費(fèi)大量人力和時(shí)間，而且受實(shí)驗(yàn)人員的主觀因素影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性很差，難以提供準(zhǔn)確的細(xì)胞群體量化與統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。因此，量化成像流式細(xì)胞技術(shù)（ImageStream）的出現(xiàn)結(jié)合了流式檢測(cè)的高通量與熒光顯微鏡的高內(nèi)涵，同時(shí)提供細(xì)胞圖像與群體統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，給傳統(tǒng)細(xì)胞分析帶來了重大變革，在流式細(xì)胞分析、分選的傳統(tǒng)技術(shù)之外開創(chuàng)了“成像流式“下一代專家級(jí)流式細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展方向。

心腦血管研究經(jīng)常涉及分離分析原位組織中的干細(xì)胞、前體細(xì)胞等，若僅僅使用傳統(tǒng)流式分析方法，難以精確鑒定細(xì)胞。熒光顯微鏡又受通量的限制，難以捕獲稀有現(xiàn)象。量化成像流式細(xì)胞技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于高功率激光器與785nm SSC專用激光器適合分析低含量細(xì)胞，結(jié)合了量化成像高內(nèi)涵與傳統(tǒng)流式分析的高通量特點(diǎn)，準(zhǔn)確顯示稀有細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特性，并可進(jìn)一步結(jié)合細(xì)胞表面與內(nèi)部標(biāo)記物確認(rèn)該細(xì)胞群生物學(xué)功能。極小胚胎樣干細(xì)胞（VSELs）是指人類血液及骨髓中存在的一類體積非常小、數(shù)量非常稀少的多能干細(xì)胞，被認(rèn)為具有替代胚胎干細(xì)胞的潛力，其在科學(xué)界深受重視。然而，這種細(xì)胞真的存在嗎？來自肯塔基大學(xué)的一個(gè)心血管疾病研究小組利用ImageStream發(fā)現(xiàn)了心肌缺血患者VSELs遷移到外周血的證據(jù)（圖一），骨髓中這群細(xì)胞的比例僅為0.01%，表達(dá)CXCR4+、SSEA+、Oct4+和Nanog+。研究人員精確地了解到VSELs的直徑約為3.6微米左右，而造血干細(xì)胞HSC的直徑較大些，大約為6.5微米。對(duì)于核/質(zhì)比的分析發(fā)現(xiàn)，VSELs的核/質(zhì)比顯著高于HSCs，細(xì)胞質(zhì)區(qū)顯著小于HSCs。組織器官受損時(shí)（如該研究證實(shí)的心肌梗死），VSELs可能從骨髓中釋放入血液循環(huán)中，以參與損傷修復(fù)過程。而受損組織炎性因子或趨化因子的釋放，也會(huì)影響VSELs向損傷區(qū)域或其他臟器的歸巢。與此類似，ImageStream可應(yīng)用與心肌組織干細(xì)胞研究，結(jié)合高通量與形態(tài)精確鑒定，研究信號(hào)通路的活化。

圖一：心肌萎縮病人的極小胚胎樣干細(xì)胞VSELs遷移到外周血中。Lin/CD45為造血干細(xì)胞HSCs的標(biāo)記物，Oct4和CD34為極小胚胎樣干細(xì)胞VSELs的標(biāo)志物，7-AAD標(biāo)記細(xì)胞核，該研究使用了ImageStream系統(tǒng)檢測(cè)VSELs，顯示了明場(chǎng)圖像與biomarker的熒光成像，發(fā)現(xiàn)Oct4可以與細(xì)胞核共定位。
來源：Evidence of Mobilization of Pluripotent Stem Cells into Peripheral Blood ofPatients with Myocardial Ischemia.Exp Hematol. 2010 Dec; 38(12): 1131–1142.e1.

細(xì)胞自噬是一種利用溶酶體對(duì)自身細(xì)胞器進(jìn)行分解、將產(chǎn)生的大分子物質(zhì)予以回收利用的高度保守的細(xì)胞降解過程。饑餓、缺血、氧化應(yīng)激等均可誘導(dǎo)其發(fā)生。自噬的調(diào)節(jié)也與心血管疾病相關(guān)，包括心臟肥大、缺血性心臟病、心力衰竭以及缺血-再灌注損傷。正常的細(xì)胞自噬對(duì)心肌細(xì)胞有保護(hù)作用,自噬不足或自噬過度則可促發(fā)疾病或加重病變。量化成像分析技術(shù)可以（1）借助多種細(xì)胞表面與內(nèi)部標(biāo)記物追蹤自噬蛋白與自噬小體的變化，（2）統(tǒng)計(jì)自噬蛋白與溶酶體的共定位，（3）研究自噬蛋白與受體的相互作用，并可組合多種應(yīng)用模塊量化分析（4）細(xì)胞自噬與凋亡的關(guān)系、涉及的上下游信號(hào)分子。ImageStream技術(shù)在自噬方面的研究成果已有多篇發(fā)表于Science、Oncogene、Autophage、Journal of Immunology等高水平專業(yè)雜志。

ImageStream技術(shù)建立在傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)基礎(chǔ)之上，結(jié)合了熒光顯微成像技術(shù)，它具有12個(gè)檢測(cè)通道，可以對(duì)流動(dòng)中的每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行成像，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞圖像各種形態(tài)學(xué)參數(shù)量化分析，獲得全新的細(xì)胞形態(tài)統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)。ImageStream技術(shù)與傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀很類似，其系統(tǒng)平臺(tái)也是由液流系統(tǒng)，光學(xué)系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)三大部分組成。液流系統(tǒng)通過注射泵將樣本細(xì)胞懸液和系統(tǒng)鞘液注入流動(dòng)室中，細(xì)胞在鞘液流的約束下聚焦在液流的中心，逐個(gè)流過檢測(cè)窗口。光學(xué)系統(tǒng)中光源照射通過檢測(cè)窗口的細(xì)胞，從而產(chǎn)生光信號(hào)。光源分為兩種，其一用于產(chǎn)生明場(chǎng)細(xì)胞圖像，另一種是用于產(chǎn)生熒光細(xì)胞圖像的激光器。獨(dú)特、定制的全固態(tài)激光器，功率高且可調(diào)節(jié)，有利于同時(shí)檢測(cè)多種熒光信號(hào)或是微弱信號(hào)。本系統(tǒng)擁有一個(gè)獨(dú)特的785 nm激光器，用于檢測(cè)側(cè)向角（SSC）參數(shù)，極大提高了該參數(shù)的檢測(cè)靈敏度。光源照射細(xì)胞產(chǎn)生的光信號(hào)被大數(shù)值孔徑的物鏡收集，然后通過光路系統(tǒng)傳遞到由二向色鏡構(gòu)成的濾光片堆棧。光信號(hào)在這里被分成不同波段投射到CCD的相應(yīng)檢測(cè)通道上，產(chǎn)生明場(chǎng)細(xì)胞圖像、暗場(chǎng)細(xì)胞圖像和多個(gè)熒光通道的細(xì)胞圖像，即每個(gè)細(xì)胞可以獲取12副不同成像。ImageStream技術(shù)的檢測(cè)系統(tǒng)十分獨(dú)特，采用不是傳統(tǒng)流式細(xì)胞儀的PMT檢測(cè)方式，而是基于時(shí)間延遲積分技術(shù)的CCD（TDI (time delay integration) CCD）采集，保證了系統(tǒng)對(duì)高速運(yùn)動(dòng)的流體細(xì)胞也能采集高質(zhì)量圖像。