免疫組化實(shí)驗(yàn)防脫片的處理方法

脫片是免疫組織化學(xué)中經(jīng)常遇到的問(wèn)題(尤其是腦組織冰凍切片)，一般來(lái)說(shuō)脫片主要有以下幾種原因：

   1. 組織固定、脫水、透明不充分

   2．組織切片過(guò)厚

   3．組織切片有折疊

   4．過(guò)度的熱抗原修復(fù)(高壓、微波、水煮)處理或抗原修復(fù)液的pH偏高

   5．操作過(guò)程中，沖洗方法不正確等

 在實(shí)際操作的過(guò)程中，除了要注意以上幾點(diǎn)之外，防脫片的應(yīng)用是很有必要的，市售的防脫載玻片一般為正電荷玻片，不同品牌之間品質(zhì)存在差異，而即使是較好的PREMIER玻片其防脫效果有時(shí)也不能令人滿意，而且假貨較多，因此，實(shí)驗(yàn)室常常需要自己處理防脫載玻片，步驟如下：

1. 玻片的酸處理

 使用實(shí)驗(yàn)室常用的次強(qiáng)酸清潔液（重鉻酸鉀120g，濃硫酸200ml，蒸餾水1000ml）浸泡玻片24小時(shí)，流水充分沖洗后在用蒸餾水沖洗三遍，置于95%乙醇中浸泡12小時(shí)，取出放烘箱中烤干或自然風(fēng)干。

2. 黏附劑的使用

目前常用的黏附劑有三種：明膠-硫酸鉻鉀，APES（3—氨丙基—乙氧基甲硅烷），多聚左旋賴氨酸（poly-1—lysine）

（1）明膠-硫酸鉻鉀，這種方法十分簡(jiǎn)便實(shí)用，不僅用于傳統(tǒng)染色，而且能夠用于免疫組化、原位雜交等檢測(cè)，目前實(shí)驗(yàn)室大多數(shù)時(shí)候可以常規(guī)用該黏附劑。該方法的美中不足是在pH值高于8.0的堿性環(huán)境中（如使用PH9.0的TE抗原修復(fù)液）加溫到80度以上，切片還是容易脫落，因此選用此種黏附劑時(shí)宜采用PH6.0的檸檬酸鈉抗原修復(fù)液。

配制方法：將5g明膠溶解于1L熱的蒸餾水中，待冷卻后加入0.5g硫酸鉻鉀充分?jǐn)嚢枞芙�，將玻片浸泡其�?0分鐘，取出自然晾干后再次浸泡30分鐘，晾干裝盒備用。如果效不能滿足需要，可將濃度提高一倍，即10g明膠+1g硫酸鉻鉀/L。（更高的濃度本實(shí)驗(yàn)室未做嘗試）

（2）APES（3—氨丙基—乙氧基甲硅烷）要用丙酮稀釋，而丙酮有導(dǎo)致肝硬化的作用，需注意人身防護(hù)。該方法彌補(bǔ)了部分高溫堿性溶液脫片的問(wèn)題。另外，有說(shuō)法認(rèn)為已經(jīng)貼好的片子如果有脫片現(xiàn)象，可用此法浸泡3分鐘，晾干后進(jìn)行下一步，但經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證效果并不好。

配制方法：將APES用丙酮稀釋（APES:丙酮=1:50），洗凈的玻片浸入溶液中20秒，取出控去多余溶液，再浸入純丙酮或蒸餾水中洗去未結(jié)合的APES，晾干裝盒備用。（注意：此溶液需現(xiàn)用現(xiàn)配，因此盡量一次批量處理盡可能多的玻片以充分利用。）

（3）多聚左旋賴氨酸（poly-1—lysine），這種方法相當(dāng)昂貴。但是，如果進(jìn)行高壓堿性修復(fù)，可能總體上效果是最佳的。普通組化實(shí)驗(yàn)和免疫組化酸性修復(fù)（大多數(shù)的情況）則沒有必要常規(guī)使用。多聚賴氨酸一般常見的分子量有70,000～150,000，150,000～300,000和>300,000，分子量越大，黏附力越強(qiáng)，但相對(duì)完全溶解較困難。

配制方法：按照0.1mg/ml的濃度用雙蒸水溶解多聚賴氨酸，將洗凈的玻片盡在溶液中5分鐘（增加時(shí)間不會(huì)提高粘附效果），自然晾干裝盒備用。如果要節(jié)約試劑，可使用直接涂布法，用移液器吸取溶液涂布于玻片上需要貼片的區(qū)域，可隨意控制面積大小，一般用量控制在20μl/cm2。（注意：1.浸泡法每100ml多聚賴氨酸溶液包被的片子一般不超過(guò)100張，包被過(guò)多會(huì)降低粘附力。2.多聚賴氨酸溶液4℃保存，一年內(nèi)穩(wěn)定。3.冰箱內(nèi)取出的多聚賴氨酸溶液使用前要先恢復(fù)到室溫方可正常使用。）

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