熒光顯微鏡成像質(zhì)量的決定因素

熒光光學(xué)系統(tǒng)的成像質(zhì)量主要取決于像的襯度和像的亮度，像的襯度是由樣品中激發(fā)出的熒光與背景上觀察到的光之比決定的。背景光包括透過截止激發(fā)光的濾色片的雜散激發(fā)光，樣品組織成分的自發(fā)熒光和光學(xué)系統(tǒng)的自發(fā)熒光和雜散光，在熒光顯微術(shù)中盡全力要解決的是既獲得最佳的像襯度，同時又維持像有足夠亮度，這兩者往往是矛盾的。例如用極窄波帶濾色片激發(fā)時僅利用了極少的光能，背景暗了但熒光亮度也弱了。在應(yīng)用時，只能兼顧，合理的權(quán)衡以決定取舍。

熒光顯微光學(xué)系統(tǒng)需要優(yōu)先考慮的是：

(1) 光學(xué)系統(tǒng)組成的材料應(yīng)選用在激發(fā)光波內(nèi)無熒光材料，不但指光學(xué)系統(tǒng)玻璃也包括膠合制造中的膠合劑、切片、蓋玻片和浸液以及密封劑。若有自發(fā)熒光，不但會增加背景光，有時還會混淆觀察熒光圖像。

(2) 光學(xué)系統(tǒng)的參數(shù)選擇中, 應(yīng)將獲得最大光能作為第一考慮因素。

照明系統(tǒng)中集光鏡應(yīng)選用最大的包容角； 采用柯勒照明并使燈絲或弧光像充滿入瞳，以期望獲得高效率的均勻照明。

收集熒光成像的物鏡，因為像面照度與數(shù)值孔徑NA 2 成正式，為此作為熒光用物鏡應(yīng)有較大的NA值。目前10×已達015；20×達0175；40×達019；油鏡40×達113。

雙目鏡筒作為熒光用時應(yīng)在可見光譜段有較高的透過率，采用鍍膜技術(shù)可大大地減少光能的損失，它可比一般雙目鏡筒透射率提高一倍，這對弱熒光物質(zhì)觀察是必須的。

目鏡放大率不宜選大，因為象面照度與目鏡放大率平方成反比。若其它條件相同，當(dāng)用613×目鏡時，照度定為100% ，換上1215×?xí)r，照度約為25%，因此常在4×～ 613×之間選用。

由此表明，用不同物鏡和目鏡組合成同一倍率的顯微鏡時，象面照度和曝光系數(shù)可相差數(shù)倍，對于熒光觀察最佳組合是選用低倍率目鏡和NA 大的物鏡最為合適。

(3) 作為熒光光學(xué)系統(tǒng)各組成部件的光譜特性也是至關(guān)重要的，特別是紫外光要通過的部件，如照明系統(tǒng)，聚光鏡以及物鏡，要關(guān)注紫光區(qū)的透射系數(shù)。聚光鏡要選用透紫外線的材料。照明系統(tǒng)中反光鏡表面鍍鋁比鍍銀好，因為鋁在UV 和V 區(qū)反射率在90% 以上，而銀僅達70%。加拿大膠吸收紫外線，在紫外區(qū)通過處不宜用作膠合劑。

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