液相色譜耦聯(lián)Q Exactive 臺式軌道阱質(zhì)譜儀分析利妥昔單克隆抗體

液相色譜耦聯(lián)Q Exactive 臺式軌道阱質(zhì)譜儀分析利妥昔單克隆抗體

 

Martin Samonig1,2, Christian Huber1,2 and Kai Scheffler2,3

賽默飛世爾科技（中國）有限公司

 

單克隆抗體，完整蛋白質(zhì)的質(zhì)量測定，序列確定，蛋白質(zhì)去卷積，自上而下的測序

 

優(yōu)化液相色譜質(zhì)譜工作流程，采用整體柱在線耦聯(lián)Thermo Scientific Q Exactive 臺式軌道阱質(zhì)譜儀對單克隆抗體進行分析和表征。

 

單克隆抗體（mAb）是增長需求最快的醫(yī)藥產(chǎn)品之一。他們在多種病癥如癌癥、感染性疾病、過敏癥、炎癥和自免疫疾病的治療中發(fā)揮著主要作用。由于單克隆抗體可以表現(xiàn)出顯著的異質(zhì)性，作為治療產(chǎn)品，新的mAb 要獲得批準(zhǔn)需要進行大量的分析表征。質(zhì)譜法已經(jīng)成為表征單克隆抗體的重要工具，能測定完整蛋白及分離的輕鏈和重鏈的分子量、解析糖基化和糖鏈的結(jié)構(gòu)，確證正確的氨基酸序列，鑒定雜質(zhì)，如生產(chǎn)過程中固有的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)（HCP）。

 

利妥昔單抗是一個拮抗蛋白質(zhì) CD20 的重組單克隆抗體，其在美國的商品名為 RituxanR（Biogen Idec 公司/ 基因泰克公司），在歐洲的商品名為 MabTheraR（羅氏）。它是第一代腫瘤免疫治療藥物之一。利妥昔單抗分別在1997 年被美國食品和藥物監(jiān)督管理局和1998 年由歐盟委員會批準(zhǔn)用于惡性淋巴瘤的治療。這個抗體的可變區(qū)域作用靶點為細(xì)胞表面分子 CD20，這些分子存在于一些非霍奇金淋巴瘤中。

 

在這個應(yīng)用報告中，結(jié)合使用自上而下和自下而上的方法，不管是分析完整和還原的利妥昔單抗，還是對其進行氨基酸序列分析，Q Exactive Orbitrap 質(zhì)譜儀都具有優(yōu)異的表現(xiàn)。

 

 

此外，評價了兩套整體柱色譜系統(tǒng)在線耦合質(zhì)譜儀的靈敏度。數(shù)據(jù)表明Q Exactive 系統(tǒng)具有優(yōu)異的分辨率和質(zhì)量準(zhǔn)確度，是一個具有高置信度的篩選工具，可快速精確地進行生物制藥產(chǎn)品的開發(fā)和表征。

 

 

本研究所有實驗均采用商品化的單克隆抗體利妥昔。利妥昔是一種無菌，透明，無色，不含防腐劑的靜脈滴注用濃縮液。該產(chǎn)品濃度為 10 mg/mL，通常配制成7.35 mg/mL 的檸檬酸鈉緩沖注射液，其中含 0.7 mg/mL聚山梨醇酯 80、9.0 mg/mL 氯化鈉和無菌水，采用氫氧化鈉或鹽酸水溶液調(diào) pH 值至 6.5。

 

由于利妥昔單抗中含聚山梨醇酯80，在進行 LC / MS 分析之前需對樣品進行透析。采用截留分子量為 3.5 kDa（MWCO）的Thermo ScientificTM Slide-A-LyzerTM 透析盒透析。在 4℃ 條件下，1 mL 利妥昔單抗在 2 L 20％ 乙腈水溶液中透析 48 h。

 

對利妥昔單抗的輕鏈和重鏈進行分析時，樣品與 5 mM 三羧甲基磷酸（TCEP）在 60℃ 條件下孵育 30 min，還原樣品中的二硫鍵。

 

為了對酶切后的 mAb 進行自下而上的分析，樣品還原后，繼續(xù)在室溫暗處與 20 mM 碘乙酰胺（IAA）進行烷基化反應(yīng) 30 min。樣品采用 Thermo ScientificTM PierceTM C18 槍頭進行純化，采用 Thermo ScientificTM SpeedVaccTM 旋轉(zhuǎn)濃縮儀進行干燥，然后溶解在 0.5 M 三乙基碳酸氫銨緩沖液（TEAB ）中。在 0 h 和 1.5 h 先后兩次，按照 1:15（w/w）的比例加入測序級修飾胰蛋白酶（Promega），在 37 ℃ 條件下酶切 2.5 h。最后，加入適量三氟乙酸（TFA），調(diào) pH 值至約為 3。

 

所有樣品放在含玻璃內(nèi)插管的自動進樣器小瓶中（0.1 ml微量內(nèi)插管，透明玻璃，VWR）。

 

實驗使用的色譜柱為按照文獻制備的 160×0.20 mm 內(nèi)徑聚（苯乙烯- 二乙烯基苯）（PS-DVB）共聚物毛細(xì)管柱【1】和 Thermo ScientificTM PepSwiftTM 250×0.20 mm 內(nèi)徑的 PS-DVB毛細(xì)管柱。蛋白質(zhì)的分離使用 Thermo ScientificTM DionexTM UltiMateTM 3000 RSLCnano 系統(tǒng)，該系統(tǒng)配置 3 nL z- 型微量檢測池。分離過程中，柱溫：55℃，流速：1 μL/min，色譜梯度：乙腈（ACN）溶液（含 0.05% 三氟乙酸 TFA）的濃度從 20%升高至 60%，運行時間：10 min。對于胰蛋白酶的酶切混合物，色譜梯度：B 相濃度從 0% 升高至 50%，運行時間：30 min。對于還原型抗體，色譜梯度：B 相濃度從 35% 升高至 45%，運行時間：15 min。

 

采用 Thermo ScientificTM ProSwiftTM RP-10R 50 mm×1.0 mm 內(nèi)徑的整體柱在更高流速分離蛋白質(zhì)，使用的儀器為 Thermo ScientificTM DionexTM UltiMateTM 3000 RSLCnano 系統(tǒng)，該系統(tǒng)配置 45 nL 檢測池。分離過程中，柱溫設(shè)置為 55℃，流速為60 μL/min。色譜梯度：B 相濃度從 26% 升高至 80%，運行時間：20 min。對于還原型抗體，分離輕鏈和重鏈的色譜梯度：B 相濃度從 26% 升高至 56%，運行時間：20 min。

 

在上述梯度條件下，PepSwift 250 mm×0.2 mm 內(nèi)徑的整體柱壓力在 190 bar 到 260 bar 之間，ProSwift RP-10R 50 mm×1 mm內(nèi)徑的整體柱壓力在 120 bar 到 180 bar 之間。

 

在本研究的所有實驗中，流動相 A 是 0.05% 三氟乙酸水溶液，流動相 B 是 0.05% 三氟乙酸的乙腈溶液。色譜梯度見表 1 和表 2。

 

表 1. 本實驗所用的液相色譜梯度，

色譜柱： PepSwift 250 mm×0.2 mm 內(nèi)徑，流速：1 μL/min

 

表2. 本實驗所用的液相色譜梯度，

色譜柱：ProSwift RP-10R 50 mm×1 mm 內(nèi)徑，流速：60 μL/min

 

本研究所有實驗均采用 Q Exactive 臺式靜電場軌道阱質(zhì)譜儀。采用 ProSwift RP-10R 50 mm x 1 mm 內(nèi)徑色譜柱進行實驗時配合使用Thermo ScientificTM IonMaxTM 加熱電噴霧離子源，噴霧電壓為 4 KV，鞘氣和輔助氣流速分別為 15 和 5個單位。

 

其他實驗均采用 Thermo ScientificTM NanoFlexTM 離子源進行，離子源上配置 15 cm 的 PicoTipR 噴霧針（New Objective，Woburn，USA；20 μm 內(nèi)徑，360 μm 外徑，10 μm 針尖)，流速為 1 μL/min，電壓為 1.5 KV。

 

詳細(xì)方法設(shè)置見表 3。

 

表 3. 本研究所有實驗用到的質(zhì)譜參數(shù)

 

源內(nèi) CID（SID）是一個 DC 補償參數(shù)（0-100 eV），通常加在源內(nèi) DC 補償電壓上。源內(nèi) DC 補償電壓由三個電壓組成：毛細(xì)管 DC，S-lens DC 和 S-lens 的出口透鏡。通過設(shè)置源內(nèi) CID 參數(shù)來應(yīng)用 DC 補償電壓，應(yīng)用該電壓會導(dǎo)致多極桿進樣池內(nèi)的分析物與儀器離子源區(qū)域殘留的氣體分子發(fā)生碰撞。

 

全離子裂解（AIF）是裂解模式的一種，源內(nèi)產(chǎn)生的所有離子由質(zhì)譜儀的離子光學(xué)組件引導(dǎo)，在 C-trap 內(nèi)累積，然后一起送入高能裂解池進行裂解。在這種情況下，四極桿的設(shè)置并不是選擇某一特定母離子，而是采用所有離子均通過的模式（RF-only）。在分析完整蛋白時，這是一種非常有用的方法，因為不同電荷態(tài)往往有不同的裂解模式，因此并不容易預(yù)測哪一種模式最好。

 

 

采用 Thermo ScientificTM Protein DeconvolutionTM 軟件 2.0 版對一級質(zhì)譜圖進行去卷積。分辨率為 17500 時得到的完整抗體和完整重鏈質(zhì)譜圖，用 ReSpect ™ 算法去卷積。分辨率為 140000 時獲得的完整輕鏈質(zhì)譜圖和分辨率為 70000時得到的自上而下的譜圖用 Xtract 算法去卷積。為了鑒定完整抗體和還原后的完整重鏈的糖型，我們將已知各種常見糖型組合的分子量與測定分子量進行比較。

 

采用 Thermo ScientificTM Qual BrowserTM 儀器中的 Xtract 算法對自上而下的 HCD 和 AIF 質(zhì)譜圖去卷積。使用 ThermoScientificTM ProSightPCTM 軟件 3.0 版本的單個蛋白質(zhì)模式對碎片離子進行歸屬，碎片離子質(zhì)量誤差設(shè)為5ppm。

 

采用 Thermo ScientificTM Proteome DiscovererTM 軟件 1.4 版本SEQUESTR 算法對胰蛋白酶酶切物的數(shù)據(jù)進行檢索分析。數(shù)據(jù)庫由三種蛋白組成：胰蛋白酶、輕鏈和重鏈的兩個異構(gòu)體（在 219 位為Ala 或者 Val）。母離子質(zhì)量誤差設(shè)為 10 ppm，碎片離子的質(zhì)量誤差設(shè)為 20 mmu�？紤]四個可變修飾：烷基化（半胱氨酸）、氧化（甲硫氨酸）、脫酰胺（天冬酰胺，谷氨酰胺）、谷氨酰胺轉(zhuǎn)換為焦谷氨酸，和 N，N- 二甲基化（賴氨酸）（僅與胰蛋白酶自酶切產(chǎn)物鑒定相關(guān)）。

 

利妥昔單抗是拮抗 CD20 蛋白的 IgG1 類單克隆抗體，由兩條輕鏈（213 個氨基酸）和兩條重鏈（451 個氨基酸）組成。輕鏈和重鏈通過 12 個鏈內(nèi)和 4 個鏈間的二硫鍵連接（圖 1）。在該抗體兩個重鏈的 Asn301 處有糖鏈結(jié)構(gòu)。連接的糖鏈組成和長度是變化多端的，從而導(dǎo)致該分子具有微觀異質(zhì)性。作為一種生物藥，保持不同糖結(jié)構(gòu)的種類和相對豐度是發(fā)揮抗體療效必不可少的。附著在抗體上的常見糖的命名如圖2所示。

 

圖 1. 人源IgG1 屬的單克隆抗體利妥昔的分子結(jié)構(gòu)示意圖

 

圖 2. 抗體上常見的糖鏈結(jié)構(gòu)的命名

 

圖 3 顯示的是用 250×0.2 mm 內(nèi)徑整體柱分析 20 ng 利妥昔抗體得到的一級質(zhì)譜圖。在 m/z 1800–5000 范圍內(nèi)采集的質(zhì)譜圖顯示了大分子蛋白質(zhì)的典型電荷分布。插圖顯示的是 m/z 3269 時，放大的最大豐度電荷態(tài)（z=+45)，其很好地描繪了完整抗體 4 個豐度最高的糖型。

 

 

圖 3. 利妥昔抗體的單張全掃描質(zhì)譜圖（10 個microscan），用 250×0.2 mm 內(nèi)徑色譜柱分析 10 ng 利妥昔抗體。插圖顯示的是放大的最強豐度電荷態(tài)(z=+45)，觀察到的峰型代表該分子的不同糖型。

 

通過將完整一級質(zhì)譜圖去卷積，獲得了四個最強豐度糖型的完整質(zhì)量數(shù)和一系列較低豐度糖型的質(zhì)量數(shù)（如圖 4所示）。根據(jù)蛋白序列計算得到的理論分子量并結(jié)合圖 2中各種預(yù)測糖鏈的結(jié)構(gòu)進行峰歸屬。

 

 

圖4. 利妥昔抗體去卷積的質(zhì)譜圖和不同糖型歸屬（上圖），5 個最強豐度糖型的理論質(zhì)量數(shù)和測定質(zhì)量數(shù)的對比（表）

 

為了獲得完整抗體的一級譜圖，我們對源內(nèi) CID 的設(shè)置參數(shù)進行了優(yōu)化。該參數(shù)對獲得高質(zhì)量的譜圖至關(guān)重要。

 

對于大多數(shù)蛋白質(zhì)來說，源內(nèi) CID 一般在 25%-90% 較為適合，對于這個樣品來說，最優(yōu)設(shè)置為 80% SID。

 

 

圖 5. 在不同 SID 設(shè)置條件下，1 ng 完整利妥昔抗體的一級質(zhì)譜圖

 

表 4 顯示的是輕鏈、非糖基化重鏈和完整抗體的計算質(zhì)量數(shù)，分別從輕鏈的 213 和重鏈的 451 位氨基酸開始逐步計算。兩個蛋白序列都包含的 N- 末端谷氨酰胺應(yīng)會被修飾為焦谷氨酸，這將導(dǎo)致質(zhì)量數(shù)丟失 17.0265 Da。此外，重鏈中 C- 末端賴氨酸有可能被切掉，導(dǎo)致質(zhì)量數(shù)丟失128.09497 Da。在構(gòu)成完整抗體時，形成 16 個二硫鍵會丟失 32 個質(zhì)子。兩條重鏈上攜帶的糖鏈導(dǎo)致其質(zhì)量數(shù)將會增加 1217.1-2352.1 Da。兩條重鏈上可以攜帶不同的糖鏈，從而形成混合組成物，例如 G01/G2F。各個糖鏈的化學(xué)組成和質(zhì)量數(shù)列在表 5 中。用于計算表 4 和表 5 中分子量的元素的單同位素和平均原子質(zhì)量列于表 6 中。

 

表 4. 分別對帶有不同修飾及不同糖型的利妥昔單克隆抗體的輕鏈和重鏈進行化學(xué)組成分析以及單同位素分子量和平均分子量的逐步計算。圖 4、圖 6 和圖 7 的藍(lán)色格子顯示了檢測到的分子量。

 

 

表 5. 單糖的化學(xué)組成和分子量

 

 

表 6. 用于計算表 4 和表 5 分子量的元素的單同位素原子量和平均原子量

 

最初的計算是根據(jù)發(fā)表在 DrugBank 數(shù)據(jù)庫【2】的序列進行的，然而計算結(jié)果與我們實驗測得的質(zhì)量數(shù)并不匹配。通過將 DrugBank 中的序列與之前文獻發(fā)表過的序列【3】進行比對，發(fā)現(xiàn)位于重鏈保守區(qū)域 219 位上的一個氨基酸不同，是丙氨酸而不是纈氨酸。 使用219 位為丙氨酸的序列的計算結(jié)果可以與完整蛋白質(zhì)量數(shù)測定的結(jié)果以及先前報道的結(jié)果完全吻合【4】。為了進一步確認(rèn)這點，我們進行了一系列的補充實驗。

 

將抗體還原后（無烷基化），采用設(shè)置不同分辨率的方法分析已分離的輕鏈和重鏈，來觀察在此分子量下能否實現(xiàn)同位素解析。由于輕鏈分子量較小，有可能得到同位素解析譜圖，而重鏈無法得到，因為重鏈質(zhì)量是輕鏈質(zhì)量的兩倍。若要采用不同的分辨率設(shè)置，方法設(shè)置分為兩個階段（從 0-15.8 min 分辨率設(shè)為 140 K，從 15.8-30min 分辨率設(shè)為 17.5 K）。通過優(yōu)化梯度，實現(xiàn)輕鏈和重鏈的色譜峰完全分離。

 

在這項研究中，我們評價了兩種整體柱（PepSwift 250 mm×0.2 mm 內(nèi)徑和ProSwift RP-10R 50 mm×0.1 mm 內(nèi)徑），輕鏈和重鏈兩峰分離的保留時間之差均可大于 2 min（圖 6）。分別對輕鏈和重鏈的質(zhì)譜圖（圖 6b 和 6c）去卷積。輕鏈的同位素解析質(zhì)譜圖用 Xtract 算法去卷積，得到了單一同位素分子量23,025.3758 Da，與計算分子量只差 2.5 ppm。重鏈用 ReSpect 算法去卷積，產(chǎn)生三個峰，每一個峰代表一種主要的糖型，G0F，G1F 和 G2F（圖 7）。

 

 

圖 6. 還原型利妥昔抗體的色譜圖（A），輕鏈的一級全掃描質(zhì)譜圖（B）和重鏈的一級全掃描質(zhì)譜圖（C）。

C 中的插圖顯示的是電荷態(tài) z=+25 的放大圖，三個峰代表三種不同的糖型。

 

 

圖 7. 輕鏈和重鏈的去卷積結(jié)果。在分辨率 140,000 全掃描模式下獲得輕鏈的質(zhì)譜圖，通過 Xtract 算法去卷積，得到準(zhǔn)確的單同位素分子量和完整的同位素分布圖（左圖）。在 17,500 的分辨率下測得重鏈的質(zhì)譜圖，通過 ReSpect 算法去卷積，得到了平均分子量（右圖）。

 

為了評價使用 250×0.2 mm PepSwift 整體柱時儀器的檢測限，采集了一系列進樣量的 LC/MS 樣品。將 50pg-20ng 的完整抗體從最低濃度開始注入色譜柱（圖 8）。在序列開始之前和各樣品之間運行兩針空白樣品，以排除殘留的影響。通過這種方法，我們發(fā)現(xiàn)完整抗體的最低檢測限是500pg，在進樣量為500pg的時候，仍然可以得到較好的譜圖，從譜圖上可以看到完整抗體中豐都最高的糖型。需要指出的是，最低濃度的樣品必須現(xiàn)配，分析前不能在自動進樣器中存放數(shù)小時。

 

 

圖 8. 用 250 mm×0.2 mm PepSwift 整體柱分析完整的利妥昔抗體，上樣量為 -20 ng-500pg 一系列稀釋濃度得到的一級全掃描質(zhì)譜圖。

 

在 50 mm×1 mm 內(nèi)徑 ProSwift 整體柱上，進樣量為 30 ng和 150 ng 的時候，完整抗體都可以得到高質(zhì)量的譜圖（圖 9），

 

根據(jù) 30 ng 的上樣量，我們預(yù)測最低進樣量在 5 ng-10 ng 之間，在此范圍內(nèi)仍然可以得到優(yōu)質(zhì)的譜圖。

 

 

圖 9. 用 50 mm×1 mm ProSwift 整體柱分析完整的利妥昔抗體，上樣量分別為150 ng 和30 ng時的一級全掃描質(zhì)譜圖（左側(cè)）和最高豐度電荷態(tài)放大圖（右側(cè)）。

 

接下來，我們試圖進一步確認(rèn)輕鏈和重鏈的序列，進行了兩類自上而下的實驗：在 HCD 池中進行全離子裂解（AIF），或選擇輕鏈和重鏈的 5 個電荷態(tài)進行多重（5-plex）目標(biāo)離子二級質(zhì)譜實驗。所有譜圖都是在分辨率為 70000下采集。目標(biāo)離子譜圖的采集使用基于保留時間的質(zhì)量數(shù)列表，包括先流出的輕鏈質(zhì)荷比（保留時間 13.16 min：m/z 1536.96、1646.6、1773.3、1920.7、2095.4）和后流出的重鏈（ 保留時間 16 -20min：m/z 1584.6、1635.7、1684.7、1748.5、1810.9 ）。在這類實驗中，內(nèi)含物列表中的第一個電荷態(tài)被選擇并送到 HCD 池中進行裂解，子離子儲存在 HCD 池中，同時分離第二個電荷態(tài)送到 HCD 池，裂解并貯存在該池中，直到第 5 個電荷態(tài)被裂解。5 個單獨分離和裂解步驟產(chǎn)生的所有離子被一起送到 Orbitrap 分析器中，產(chǎn)生一個單一的碎片離子譜圖。

所有歸為輕鏈的碎片離子（如圖 10 所示）在 N- 和 C- 末端都有好的覆蓋率，在序列的中間也有一些碎片離子匹配，最終的覆蓋率為 28%，占理論碎片的 15%。對于重鏈來說，兩種方法的裂解效率都不是特別好，約產(chǎn)生 20 個碎片離子，大多數(shù)都位于序列的末端。

 

為了進一步確認(rèn)序列，采取了自下而上的方法，將蛋白進行還原、烷基化、并用胰蛋白酶進行酶切。圖 11 顯示的是酶切后肽段混合物的色譜圖。對數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)庫檢索，數(shù)據(jù)庫由輕鏈、兩個重鏈變異體以及胰蛋白酶四個條目組成，結(jié)果顯示輕鏈的序列覆蓋率達(dá) 96%，重鏈的序列覆蓋率達(dá) 78.8%（圖 12）。兩個來自輕鏈的、較短的、沒有檢測到的肽段（LEIK 和 EAK）只能在一級質(zhì)譜圖中以完整質(zhì)量數(shù)的形式檢測到，而肽段 EAK 可以根據(jù)含漏切位點 的肽段EAKVQWK 所對應(yīng)的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)進行鑒定。綜合二級譜圖鑒定的肽段和完整短肽的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)，輕鏈的序列覆蓋率是 100%。

 

 

圖 10. 根據(jù)通過 AIF 實驗得到的碎片離子匹配利妥昔抗體輕鏈的序列覆蓋率。鑒定到 17 個 b 離子和 50 個 y 離子，對應(yīng) 15.7% 的理論碎片離子數(shù)。（426 個理論碎片離子中鑒定到 67 個離子）

 

 

圖 11. 將利妥昔抗體還原、烷基化、胰蛋白酶切后，酶切后肽段的基峰色譜圖。

 

 

圖 12. 利妥昔單抗輕鏈和重鏈的氨基酸序列。黑色字母顯示的氨基酸代表通過二級質(zhì)譜圖鑒定到的部分。綠色顯示的序列是僅通過完整肽段一級全掃描數(shù)據(jù)鑒定到的。紅色顯示的是重鏈部分的兩個氨基酸（AK），他們既不能用一級也不能用二級質(zhì)譜鑒定到。對于輕鏈來說，最終的序列覆蓋率是 100%（二級質(zhì)譜鑒定覆蓋率是 96%），對于重鏈來說是 99.5%（二級質(zhì)譜鑒定的覆蓋率是 98.8%）。重鏈中天冬酰胺301 表示糖基化位點。

 

對于重鏈，也可以根據(jù)完整肽段的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)鑒定肽段GQPR。最后，根據(jù)二級譜圖，含糖基化位點 Asn301 的肽段沒有鑒定到其未糖基化的形式。而對其進行基于理論糖基化修飾的數(shù)據(jù)庫檢索則很成功。此外，很容易在全掃描譜圖中檢測到糖肽，可以看到不同的糖基化形式和不同的電荷態(tài)。由于存在特征峰，二級譜圖上也很容易看到。

 

 

圖 13. 糖肽氨基酸序列 297-305 (EEQYN*STYR, *=G0F) 的二級質(zhì)譜圖，其母離子是三價電荷。

插圖顯示的是在全掃描質(zhì)譜圖中二價和三價母離子的同位素分布。

 

圖 13 顯示的是一個含 G0F 肽的譜圖舉例，顯示了完整母離子和用 HCD 裂解糖肽得到的典型裂解類型：質(zhì)量數(shù)為204 的 hexonium 離子（HexNAc）和質(zhì)量數(shù)為 366 的離子（Hex-HexNAc）以及階梯式碎片離子：己糖（m/z 162）、N-乙�；�氨糖（203）和巖藻糖（146）。綜合考慮基于所有肽段的一級全掃描和基于數(shù)據(jù)庫搜索的二級質(zhì)譜圖，重鏈的序列覆蓋率達(dá) 99.5%，只有兩個氨基酸（ 氨基酸 343-344）沒有檢測到。

 

在本研究中，我們提供一種新流程，結(jié)合快速色譜，利用兩種規(guī)格的整體柱和高分辨 Orbitrap 質(zhì)譜儀，對完整及還原利妥昔進行了分析，采用 AIF，Multiplexed HCD 自上而下的裂解，以及自下而上的分析方法進行序列驗證。即使抗體的上樣量低至 500 pg，我們?nèi)钥梢缘玫礁哔|(zhì)量的質(zhì)譜圖，該數(shù)據(jù)證明了 LC-MS 儀器的高靈敏度。此外，為了分析還原型單克隆抗體，我們采用色譜的方法將抗體的重鏈和輕鏈分開，設(shè)置不同的分辨率對其進行檢測。通過這個流程，我們可以測定完整抗體的分子量，對輕鏈和重鏈的氨基酸序列進行確認(rèn)和驗證，對該抗體不同糖基化形式的相對豐度進行鑒定和評價。

 

感謝 Daniel Purstinger 在樣品制備過程中給予的幫助，感謝Remco Swart 提供本研究當(dāng)中用到的 PepSwift 和 ProSwift 整體柱。感謝奧地利聯(lián)邦經(jīng)濟、家庭、青年部和全國研發(fā)技術(shù)部提供的財政支持

 

1. Premstaller, A.; Oberacher, H. and Huber, C.G.High-Performance Liquid Chromatography-

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Monolithic Capillary Columns. Anal. Chem. 2000, 72,4386-4393.

2. http://www.drugbank.ca/drugs/DB00073

3. Nebija, D.; Kopelent-Frank, H.; Urban, E.; Noe, C. R.and Lachmann, B. Comparison of two-dimensional gel electrophoresis patterns and MALDI-TOF MS analysis of therapeutic recombinant monoclonal antibodies trastuzumab and rituximab. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2011, 56, 684–91.

4. Kuribayashi, R.; Hashii, N.; Harazono, A. and Kawasaki, N. Rapid evaluation for heterogeneities in monoclonal antibodies by liquid chromatography/mass spectrometry with a column-switching system. Journal ofPharmaceutical and Biomedical Analysis, 2012, 67-68,1-9.