Q Exactive HF應(yīng)用紀(jì)要：一小時(shí)DDA鑒定DIA定量4000個(gè)Hela蛋白

關(guān)鍵詞

QE HF； DDA； DIA； Hela；蛋白質(zhì)鑒定；定量蛋白質(zhì)組學(xué)

引言

數(shù)據(jù)非依賴性的掃描模式（data-independent acquisition, DIA）是近幾年來發(fā)展的一種新的質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集方式^[1]。它的理念是用二級碎片離子進(jìn)行蛋白相對/絕對定量。 DIA 掃描模式中，超高分辨質(zhì)譜對特定質(zhì)量范圍內(nèi)的所有母離子進(jìn)行碎裂，采集所有母離子的碎片離子，并快速地依次掃描相鄰的母離子寬口內(nèi)的所有碎片離子。 DIA 的數(shù)據(jù)中包含了所有碎片離子的保留時(shí)間和強(qiáng)度信息。用非常小的質(zhì)量偏差寬口（如 10 ppm）目標(biāo)性地抽提同一肽段的多個(gè)子離子，計(jì)算子離子的強(qiáng)度，就能對該肽段進(jìn)行鑒定和定量。 DIA 定量相比傳統(tǒng)的基于母離子強(qiáng)度的 DDA 定量有選擇性好，定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)^[1]，所以 DIA 成為定量蛋白組學(xué)新的發(fā)展方向。

Q Exactive HF 是賽默飛世爾科技在 2014 年的 ASMS 上推出的全新靜電場軌道阱超高分辨質(zhì)譜儀（圖 1）^[2,3]。 Q Exactive HF 采用了分段式四極桿技術(shù)（Advanced Quadrupole Technology， AQT）使離子傳輸效率至少提高了 2 倍；超高場 Orbitrap 技術(shù)，提高了Orbitrap 掃描速度，在 15000 分辨率時(shí)，二級譜圖的掃描速度是20 Hz。這兩項(xiàng)技術(shù)提高了 QE HF 進(jìn)行 DDA、 DIA 數(shù)據(jù)的采集能力。本文用 1 小時(shí)快速色譜梯度對 QE HF 的 DDA 鑒定能力和 DIA定量能力進(jìn)行考察，同時(shí)從定量肽段數(shù)目和 CV 兩方面對 DDA 定量和 DIA 定量能力進(jìn)行比較。

實(shí)驗(yàn)條件

實(shí)驗(yàn)材料和方法

Pierce HeLa Protein Digest Standard（貨號： 88329），稀釋至500 ng/µl， EASY-nLC 進(jìn)樣 1µl， 500 ng進(jìn)行 DDA、 DIA 數(shù)據(jù)采集，每種采集模式重復(fù) 3 遍。

高效液相色譜分離

高效液相色譜儀： EASY-nLC 1000 (Thermo Scientific^TM)
分析柱：實(shí)驗(yàn)室自制 C18, 15 cm, ID 75 µm, 3 µm
流動相： A： 0.1% 甲酸水溶液； B： 0.1% 甲酸乙腈溶液
梯度： 60 min, 3/0 – 6/2 – 22/48 – 40/53 – 80/55 – 80/60（%B/min）
流速： 300 nL/min

質(zhì)譜分析

DDA 數(shù)據(jù)采集：

質(zhì)譜儀： Q Exactive HF (Thermo Scientific^TM)；
離子源： NanoFlex 離子源；離子模式：正離子；
噴霧電壓： 1.8 kV；毛細(xì)管溫度： 275° C； S-Lens RF： 55%；
分辨率：一級 120000@m/z 200，二級 15000@m/z 200；一級
AGC： 3e6， Maximum IT： 50ms；
碰撞能量： NCE 27%； Fixed first mass: 110 m/z

DIA數(shù)據(jù)采集：

質(zhì)譜儀： Q Exactive HF (Thermo Scientific^TM)；
離子源： NanoFlex 離子源；離子模式：正離子；
噴霧電壓： 1.8 kV；毛細(xì)管溫度： 275℃； S-Lens RF： 55%；
目標(biāo) m/z 窗口： 400–1000； isolation window: 12Da；
碰撞能量： 27%； fixed first mass: 200 m/z； AGC target: 1e6；
Maximum ion injection time: atuo； loop count: 50

數(shù)據(jù)處理

Proteome Discoverer 蛋白鑒定流程：人蛋白數(shù)據(jù)庫（uniprot human_201309），母離子質(zhì)量偏差: 10 ppm；碎片離子質(zhì)量偏差： 0.02 Da；固定修飾：半胱氨酸烷基化（+57.021 Da）；動態(tài)修飾：甲硫氨酸氧化（+15.995 Da）；天冬酰胺和谷氨酰胺脫氨基化（+0.984 Da）；酶： trypsin；漏切位點(diǎn)： 2； FDR< 0.01

Skyline DDA、 DIA 蛋白定量流程： DDA 定量用 skyline MS1 filtering 功能，對每個(gè)肽段強(qiáng)度最高的 3 個(gè)母離子同位素峰進(jìn)行抽提， idotp ≥ 0.8； DIA 定量用 skyline DIA 功能，設(shè)置隔離窗口 12 Da，對給個(gè)肽段強(qiáng)度最高的 5 個(gè)子離子進(jìn)行峰抽提， mProphet 打分，控制 FDR < 0.01。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1. DIA 數(shù)據(jù)采集以及分析流程

圖 1. DDA 定量和 DIA 定量實(shí)驗(yàn)流程

500 ng Hela 細(xì)胞裂解液進(jìn)行 3 次 1 h 梯度 DDA 分析， Proteome Discoverer 1.4 數(shù)據(jù)庫檢索。將鑒定到的蛋白和肽段信息導(dǎo)入 skyline作為候選定量蛋白和肽段。基于母離子的定量用 skyline 中 MS1 filtering 功能對DDA 數(shù)據(jù)進(jìn)行母離子強(qiáng)度抽提。 500 ng Hela 細(xì)胞裂解液進(jìn)行 3 次目標(biāo) m/z 窗口 400–1000，隔離窗口 12 Da 的 DIA 分析。基于二級子離子的定量用 skyline DIA 功能對子離子進(jìn)行峰抽提， mProphet 打分，篩選 Q value < 0.01 的肽段為定量肽段。

在分析 DIA 數(shù)據(jù)之前，需要建立譜圖庫，譜圖庫中包含所有蛋白在質(zhì)譜中鑒定到的肽段，以及肽段的保留時(shí)間、碎片離子質(zhì)荷比、碎片離子強(qiáng)度等信息。數(shù)據(jù)依賴性掃描是最好的建立譜圖庫的數(shù)據(jù)采集方式。 500 ng Hela 細(xì)胞裂解液進(jìn)行三次DDA 數(shù)據(jù)采集。原始數(shù)據(jù)經(jīng) Proteome Discoverer 檢索并控制FDR < 1%。將三次 DDA 鑒定結(jié)果合并，導(dǎo)入 skyline 建立譜圖庫。 DDA 數(shù)據(jù)除了能給出蛋白和肽段的鑒定信息，還能基于母離子的強(qiáng)度/峰面積進(jìn)行定量。 Skyline 中 MS1 filtering 功能對母離子的多個(gè)同位素峰進(jìn)行抽提，并且根據(jù)同位素分布進(jìn)行打分（idotp 值）^[4]。 Idotp 代表測定的同位分布和理論同位素分布的相似度。篩選 idotp 值大于 0.8 的母離子作為可信的定量肽段。

500 ng Hela 細(xì)胞裂解液用相同的色譜柱，相同的色譜梯度，將 QE HF 切換至 DIA 掃描模式進(jìn)行 3 次 DIA 數(shù)據(jù)采集。在一次掃描循環(huán)中，目標(biāo)母離子質(zhì)核比范圍 400–1000，四極桿的隔離窗口為 12 Da，包含 50 次 MS/MS 掃描。每一張 MS/MS譜圖中包含了 12 Da 窗口內(nèi)的所有母離子的碎片離子信息。 QEHF 使用了超高場的 Orbitrap，掃描速度是 20 Hz，所以每次循環(huán)所用的時(shí)間約為 2.4–3 s，與色譜兼容（圖 2）。 Skyline 處理DIA 數(shù)據(jù)時(shí)從譜圖庫中選取強(qiáng)度最高的多個(gè)碎片離子進(jìn)行色譜峰抽提。 Skyline 中嵌入的 mProphet 軟件會根據(jù)同一肽段的多個(gè)子離子峰的 feature 進(jìn)行打分。 Feature 包括子離子共流出峰形、保留時(shí)間偏差、 dotp 值、信噪比等。為了區(qū)分假陽性的子離子峰， mProphet 可以建立 decoy 庫，也可以將打分排名第二的肽段作為decoy，計(jì)算 FDR^[5,6]。篩選 FDR < 0.01 的肽段段作為可信的定量肽段（圖 1）。