徠卡課堂 | 科研中的尖兵利器淺析——共聚焦篇

在科研的戰(zhàn)場(chǎng)上，你是否還在苦于尋找更出色的成像技術(shù)與手段？你是否還在糾結(jié)觀察到的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象能否真實(shí)的反映樣品的情況？你是否還在為圖像質(zhì)量差而不能發(fā)表高質(zhì)量的論文而苦惱？“工欲善其事必先利其器”，共聚焦將為你更好的解決這些問題。

與傳統(tǒng)的寬場(chǎng)成像相比，共聚焦作為一種高端的顯微成像術(shù)，以其出色的成像質(zhì)量及三維重構(gòu)能力，儼然已成為一種主流的成像方式。接下來小編將帶你進(jìn)入共聚焦的世界，為你淺析共聚焦的基本原理及其在生物研究領(lǐng)域的應(yīng)用。

共聚焦原理

激光共聚焦顯微鏡（Confocal laser scanning microscope，CLSM）利用放置在光源（激光）后的照明針孔和放置在檢測(cè)器前的探測(cè)針孔（pinhole）實(shí)現(xiàn)點(diǎn)照明和點(diǎn)探測(cè)，光源通過照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個(gè)點(diǎn)上，該點(diǎn)所發(fā)射的熒光成像在探測(cè)針孔內(nèi)，焦平面以外的任何發(fā)射光均被探測(cè)針孔阻擋。因此，通過共聚焦能夠清晰地獲得焦平面上的熒光信號(hào)。

圖1 左右兩邊分別是普通寬場(chǎng)顯微鏡和共聚焦顯微鏡的成像光路，共聚焦顯微鏡利用點(diǎn)探測(cè)和點(diǎn)照明技術(shù)獲得高清晰度的圖像。

計(jì)算機(jī)以像點(diǎn)的方式將被探測(cè)點(diǎn)顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上，由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像。隨著載物臺(tái)沿Z軸上下移動(dòng)，樣品的新層面又成像在顯示器上，這樣就可得到樣品不同層面的連續(xù)光切圖像(Z-stack)，進(jìn)一步通過三維重構(gòu)就能獲得樣品精確的三維信息。

圖2 左：共聚焦顯微鏡的點(diǎn)掃描及Z軸層切模式；右：通過共聚焦顯微術(shù)對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)元進(jìn)行三維重構(gòu)。

共聚焦應(yīng)用

相對(duì)于普通寬場(chǎng)成像，共聚焦能獲得高分辨率高清晰度的三維圖像，因此其應(yīng)用范圍更廣，接下來小編將介紹共聚焦顯微鏡在生物研究領(lǐng)域的幾點(diǎn)重要應(yīng)用。

熒光定位及三維重建

激光共聚焦顯微鏡最重要的應(yīng)用莫過于熒光定位的觀察與三維重構(gòu)。通過熒光定位觀察可以得知感興趣的蛋白在細(xì)胞或組織中的定位情況，而結(jié)合對(duì)細(xì)胞器或細(xì)胞骨架等結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)記可以得到該蛋白的亞細(xì)胞定位，通過與其他蛋白進(jìn)行雙色或多色共染可以分析兩個(gè)或多個(gè)蛋白的共定位情況。

圖3 左: 通過共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞微絲骨架（綠色，phalloidin）及線粒體（紅色，mitrotracker）結(jié)構(gòu)的清晰成像；右：通過共聚焦顯微鏡對(duì)果蠅卵結(jié)構(gòu)的三維重構(gòu)。

共聚焦通過點(diǎn)掃描對(duì)樣品進(jìn)行成像，通過不斷移動(dòng)Z軸實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的三維層切并通過三維重構(gòu)獲得樣品精確的三維信息（被稱為“細(xì)胞 CT”），進(jìn)而可以更準(zhǔn)確地在Z軸上分析蛋白的定位情況。

熒光定量及共定位分析

如果你要對(duì)樣品的熒光信號(hào)進(jìn)行定量，那么通過徠卡共聚焦顯微鏡操作軟件可以輕松達(dá)到這一目的，操作簡(jiǎn)便快捷。

圖4 通過共聚焦軟件對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行定量：選中quantify-intensity-stack profile選項(xiàng)，通過ROI工具框選待分析區(qū)域，在窗口中間即顯示所選區(qū)域的所有信息，包括熒光通道、平均熒光

如果你要對(duì)兩個(gè)或多個(gè)信號(hào)進(jìn)行共定位分析，我們的軟件也應(yīng)對(duì)自如。

圖5 通過共聚焦軟件對(duì)熒光信號(hào)共定位情況進(jìn)行分析：選中quantify-colocalization選項(xiàng)，通過ROI工具框選待分析區(qū)域，在窗口中間即顯示所選兩個(gè)通道的共定位參數(shù)，包括Pearson系數(shù)、共定位比率等。

多點(diǎn)掃描及拼圖

假如你的樣品需要拍攝大視野而同時(shí)又需要高分辨率怎么辦呢?不用著急，我們的軟件里有自動(dòng)拼圖功能，你只需要設(shè)置好所拍攝視野對(duì)角線上的兩個(gè)端點(diǎn)，軟件便會(huì)自動(dòng)進(jìn)行運(yùn)算并進(jìn)行自動(dòng)拼圖拍攝。同樣的，如果你不需要拼圖，僅需要拍攝多點(diǎn)，我們的軟件也可以輕松幫你實(shí)現(xiàn)。

圖6 自動(dòng)拼圖（左）和多點(diǎn)成像（右）模式。

圖7 對(duì)小鼠鼻腔層斷面的大視野高清晰度拼圖。左：48個(gè)視野的自動(dòng)拼圖（40倍物鏡），右：對(duì)左圖中框選區(qū)域的放大。

活體成像

共聚焦不僅能對(duì)固定樣品進(jìn)行成像，對(duì)活細(xì)胞或組織樣品進(jìn)行成像也是小菜一碟，只要你設(shè)置好相關(guān)參數(shù)就可以輕松拍攝了。當(dāng)然，活體拍攝過程中維持樣品活性的條件是要保證的，如細(xì)胞培養(yǎng)的溫度、濕度及二氧化碳濃度等，這都可以通過選擇共聚焦顯微鏡相關(guān)配件輕松實(shí)現(xiàn)。這樣你就可以通過活體拍攝追蹤細(xì)胞增殖、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)變化、細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號(hào)變化等生命過程了。

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視頻1 對(duì)COS7細(xì)胞中微管結(jié)構(gòu)進(jìn)行共聚焦活體成像，共拍攝5分鐘，時(shí)間間隔5秒。
（Courtesy: Dr. Yasushi Okada, University of Tokyo）

高級(jí)應(yīng)用

a . 光譜測(cè)量

在開發(fā)新的熒光蛋白/染料或?qū)χ参锶~片等自發(fā)熒光較強(qiáng)的樣品成像時(shí)，熒光蛋白/染料的激發(fā)和發(fā)射光譜就顯得尤其重要。通過共聚焦這一利器能輕松實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光蛋白/染料發(fā)射光譜的掃描，而配備最新的白激光激光器后，熒光蛋白/染料激發(fā)和發(fā)射光譜的同時(shí)掃描在分分鐘內(nèi)就能輕松搞定。

圖8 通過白激光激光器對(duì)六色熒光小球樣品激發(fā)和發(fā)射光譜的同時(shí)掃描。

b .  FRAP

（Fluorescence Recovery After Photobleaching）

借助于高強(qiáng)度激光照射細(xì)胞的某一區(qū)域使該區(qū)域熒光分子發(fā)生光淬滅，該區(qū)域周圍的非淬滅熒光分子將以一定速率向受照區(qū)域擴(kuò)散，用激光掃描共聚焦顯微鏡可直接對(duì)此擴(kuò)散速率進(jìn)行檢測(cè)，由此可以研究生物膜流動(dòng)性、細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間的物質(zhì)交流等。

圖9 熒光漂白恢復(fù)技術(shù)（FRAP的實(shí)現(xiàn)過程。

c . FRET

（Förster resonance energy transfer）

熒光共振能量轉(zhuǎn)移發(fā)生在供體熒光分子與受體熒光分子的距離足夠近且供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜相重疊時(shí)（10nm以內(nèi)）。當(dāng)供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過共振實(shí)現(xiàn)能量向鄰近受體分子轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。發(fā)生FRET后，供體的熒光強(qiáng)度比它單獨(dú)存在時(shí)要低的多，而受體發(fā)射的熒光卻大大增強(qiáng)。通過FRET可以檢測(cè)分子間的相互作用及分子的折疊與構(gòu)象變化。

圖10熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（FRET）的原理。

以上高級(jí)功能的應(yīng)用都可通過選擇拍攝軟件中的相應(yīng)模塊快速的實(shí)現(xiàn)。

小結(jié)

共聚焦顯微鏡作為科研中的尖兵利器，其應(yīng)用還遠(yuǎn)不止上面提到的這些。而徠卡新一代頂級(jí)共聚焦顯微鏡Leica TCS SP8 X配備了白激光激光器（獨(dú)有的AOBS分光系統(tǒng)）、棱鏡分光狹縫檢測(cè)系統(tǒng)、AFC自動(dòng)對(duì)焦裝置、超高靈敏檢測(cè)器HyD（配合白激光可實(shí)現(xiàn)高清晰度高分辨率的門控成像）、Hyvolution圖像處理軟件（通過反卷積處理可達(dá)到130nm高分辨率）等，能輕松實(shí)現(xiàn)以上所有應(yīng)用。同時(shí)，其強(qiáng)大的擴(kuò)展性使SP8能輕而易舉升級(jí)為STED超高分辨率顯微鏡、MP多光子成像系統(tǒng)、Hi speed高速掃描系統(tǒng)等進(jìn)而實(shí)現(xiàn)更多更強(qiáng)大的應(yīng)用，可以說SP8 X共聚焦顯微鏡作為科研界的尖兵利器當(dāng)之無愧。