PCR原理及常見(jiàn)問(wèn)題解答

PCR (Polymerase Chain Reaction)，中文翻譯為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制。 由1983年美國(guó)Mullis首先提出設(shè)想，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)，即簡(jiǎn)易DNA擴(kuò)增法，意味著PCR技術(shù)的真正誕生。到如今，PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究、遺傳工程、法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)、人類(lèi)學(xué)等領(lǐng)域。

PCR原理
  PCR技術(shù)的基本原理類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴(lài)于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，雙鏈DNA解離，成為單鏈；②模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)此過(guò)程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”。

PCR引物設(shè)計(jì)基本原則
①引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右。
②引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。
③兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3'端的互補(bǔ)重疊。
④引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過(guò)70%，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。
⑤引物的5'端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

PCR反應(yīng)特點(diǎn)
特異性強(qiáng)
簡(jiǎn)便靈敏
純度要求低

常見(jiàn)問(wèn)題與解答
1、Q: 不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶？
A: 在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病。例如，模板中含有雜蛋白質(zhì)，在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦不宜隨意更改。
2、Q: 出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，但其條帶更整齊，亮度更高（假陽(yáng)性）。
A: 出現(xiàn)假陽(yáng)性的原因有：①引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。因此，需重新設(shè)計(jì)引物。②靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。
3、Q: 出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶？
A: 非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg²⁺離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。三是酶的質(zhì)和量，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。
4、Q: 出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶？
A: 其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過(guò)高，Mg²⁺濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。其對(duì)策有：①減少酶量，或調(diào)換另一來(lái)源的酶。②減少dNTP的濃度，適當(dāng)降低Mg2+濃度。③增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。