殼聚糖降解物改善巨噬細(xì)胞構(gòu)建微環(huán)境促進(jìn)外周神經(jīng)再生

研究背景

外周神經(jīng)系統(tǒng)（PNS）損傷后的修復(fù)涉及到非常復(fù)雜的生物學(xué)功能。殼聚糖作為一種人工神經(jīng)導(dǎo)管，在治療PNS修復(fù)過程中有非常顯著的效果。當(dāng)然，在這個過程中，殼聚糖的作用不僅僅是作為神經(jīng)修復(fù)的支架，其降解產(chǎn)物殼寡糖（COS）是具有促進(jìn)組織再生功能的。然而，目前這種現(xiàn)象的具體作用機(jī)制還不是很清楚。本研究組之前的研究發(fā)現(xiàn)，COS通過miR-27a/FOXO1促進(jìn)細(xì)胞周期，刺激Schwann cells（SCs）增殖而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)新COS通過調(diào)控miR-327,刺激SCs細(xì)胞分泌趨化因子，進(jìn)而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞創(chuàng)造穩(wěn)定微環(huán)境，使得神經(jīng)能夠再生。

研究思路  

研究結(jié)果

1. COS促進(jìn)受傷坐骨神經(jīng)處SC增殖和軸突延伸

       為探究COS對神經(jīng)修復(fù)的作用，我們首先通過大鼠模型，在受傷坐骨神經(jīng)移植COS和陽性對照NGF及鹽處理對照。12天后的表型分析顯示，COS和NGF組修復(fù)都非常好，SCs增殖顯著，NF陽性軸突顯著增加。因此，這部分的建模實驗和處理，非常好地表明了COS對神經(jīng)修復(fù)的作用。

2. COS誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)和巨噬細(xì)胞招募

       已有的研究發(fā)現(xiàn)器官再生時的微環(huán)境塑造過程中，炎癥因子扮演著非常重要的作用。因此，我們首先檢測了受傷后不同時間點(diǎn)的炎癥因子表達(dá)。結(jié)果顯示，TNF-α，IL-6，IL-1β快速升高，表明炎癥細(xì)胞可能被招募到受傷區(qū)。通過免疫染色，我們發(fā)現(xiàn)CD68陽性細(xì)胞在4天就達(dá)到峰值。因此，這些數(shù)據(jù)都表明，COS會快速激活炎癥因子表達(dá)和巨噬細(xì)胞積累。

3. COS依賴于SCs刺激巨噬細(xì)胞遷移

       那么，COS招募巨噬細(xì)胞的內(nèi)在機(jī)制是什么呢？利用巨噬細(xì)胞模型RAW246.7，我們進(jìn)行了COS處理，發(fā)現(xiàn)遷移沒有明顯變化。因此，我們在此基礎(chǔ)上，通過wound-healing實驗，我們把COS處理的RAW246.7與SCs共培養(yǎng)。結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞發(fā)生了遷移，且被COS強(qiáng)化，但又不是因為增殖引起。因此，COS依賴于SCs刺激巨噬細(xì)胞遷移。

4. COS引起SCs內(nèi)的miRNA和mRNA變化

       我們前期的測序結(jié)果（該研究中RNA測序服務(wù)由伯豪生物提供）表明COS處理SCs后，有172個差異miRNA和4399個mRNA表達(dá)變化。在這里，我們重點(diǎn)關(guān)注了傷口應(yīng)激，免疫應(yīng)激，TNF胞內(nèi)反饋，器官再生和細(xì)胞因子調(diào)控信號通路。GO和KEGG功能富集顯示，共有51個miRNA和77個mRNA符合以上指標(biāo)。進(jìn)一步的miRNA和mRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，我們現(xiàn)在共有兩個大類出現(xiàn)：一個涉及到增殖，包含miR-182,miR-345-5p等；一個涉及到炎癥，包含miR-327,miR-193-3p，miR-20a-5p，CCL2,CCL7等。同時，miR-327,miR-193-3p的潛在靶基因是CCL2, miR-17-5p和 miR-106-5p的潛在靶基因是CCL7。因此，我們把他們作為接下來研究的候選。

5. MiR-327在SCs中降低CCL2的表達(dá)

       當(dāng)SCs處理COS后，miR-327下調(diào)，CCL2顯著上調(diào)，而miR-193沒有顯著變化。所以，可能是miR-327在SCs中調(diào)控了CCL2。因此，我們用熒光素酶報告系統(tǒng)進(jìn)行了驗證，確實發(fā)現(xiàn)miR-327可以結(jié)合到miR-327的3’UTR區(qū)，抑制其表達(dá)。 6. SC中的MiR-327/CCL2調(diào)控巨噬細(xì)胞遷移
       為確認(rèn)miR-327/CCL2是否參與巨噬細(xì)胞的招募過程，我們進(jìn)行了transwell 遷移實驗。通過在SCs中siRNA敲降CCL2,我們發(fā)現(xiàn)RAW264.7細(xì)胞的遷移能力減弱。同樣，miR-327的過表達(dá)和敲降實驗也得到了一致的結(jié)果。

7. COS調(diào)控坐骨神經(jīng)中的miR-327/CCL2

       以上的功能實驗都是基于細(xì)胞，那么，在真實的坐骨神經(jīng)受傷時，miR-327/CCL2調(diào)控通路是否存在的？我們在大鼠COS移植外周神經(jīng)缺陷模型后，檢測miR-327的表達(dá)。結(jié)果顯示，術(shù)后1天和4天，表達(dá)顯著降低，而CCL2顯著增加。因此，SCs中的CCL2在招募巨噬細(xì)胞在創(chuàng)口處營造適宜微環(huán)境影響神經(jīng)再生過程中，確實發(fā)揮了非常重要的調(diào)控作用。

研究結(jié)論

       我們的研究通過模型構(gòu)建和檢測，發(fā)現(xiàn)殼聚糖降解物COS在神經(jīng)修復(fù)過程中有重要作用。運(yùn)用高通量測序和后續(xù)實驗驗證，我們闡明了COS通過SC s中的miR-327，調(diào)控CCL2的表達(dá)，進(jìn)而影響了巨噬細(xì)胞的遷移和招募，最終通過傷口處的微環(huán)境重塑而影響外周神經(jīng)再生的生物學(xué)機(jī)制。我們的研究為理解殼聚糖降解物在神經(jīng)修復(fù)過程中的作用提供了理論依據(jù)。

原文出處：Zhao Y, Wang Y, Gong J, et al. Chitosan degradation products facilitate peripheral nerve regeneration by improvingmacrophage-constructed microenvironments.Biomaterials,2017.