與CRISPR/Cas系統(tǒng)相愛相殺的抗CRISPR蛋白研究最新進展
CRISPR/Cas系統(tǒng)是目前發(fā)現(xiàn)存在于大多數(shù)細菌與所有的古菌中的一種免疫系統(tǒng)，被用來識別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防御系統(tǒng)。在CRISPR/Cas系統(tǒng)中，CRISPR是規(guī)律間隔性成簇短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）的簡稱，涉及細菌基因組中的獨特DNA區(qū)域，也是儲存病毒DNA片段從而允許細胞能夠識別任何試圖再次感染它的病毒的地方，CRISPR經(jīng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA序列（被稱作crRNA）識別入侵性病毒的遺傳物質(zhì)。Cas是CRISPR相關蛋白（CRISPR-associated proteins, Cas）的簡稱，Cas蛋白像一把分子剪刀那樣切割細菌基因組上的靶DNA。
細菌與感染細菌的病毒（噬菌體）之間的生存之戰(zhàn)導致了許多細菌的防御系統(tǒng)得到進化，同時噬菌體也針對這些系統(tǒng)進化出了新的拮抗物：抗CRISPR蛋白。CRISPR-Cas系統(tǒng)是細菌保護自己防御噬菌體的一種最常見方法，它在許多細菌體內(nèi)作為適應性免疫系統(tǒng)發(fā)揮重要作用。目前CRISPR-Cas9系統(tǒng)已經(jīng)越來越廣泛地得到科學家們的青睞，用于基因修飾和基因功能研究。
鑒于已知Cas9核酸內(nèi)切酶在細胞內(nèi)逗留太久會導致脫靶效應，科學家們正在努力開發(fā)Cas9關閉開關在理想的情況下，Cas9會發(fā)現(xiàn)完美的靶標，隨后一種Cas9抑制劑阻止這種酶發(fā)生額外地切割。如今有研究證實病毒進化出的反制措施，即被稱作抗CRISPR蛋白（anti-CRISPR）的抑制性蛋白，能夠被用來改進作為一種基因治療工具的CRISPR-Cas9，從而降低可能導致不良副作用的脫靶基因編輯。
在此之前，小編針對CRISPR/Cas系統(tǒng)開展大量的總結(jié)和分析，但是未專門針對抗CRISPR蛋白開展過相關的總結(jié)�；诖耍【幪氐蒯槍笴RISPR蛋白近年來取得的進展，進行一番盤點，以饗讀者。
1.Nature：CRISPR-Cas也有天敵！
doi:10.1038/nature15254
近日，來自加拿大多倫多大學的研究人員在著名國際學術期刊Nature上發(fā)表了一項最新研究進展，他們在這項研究中首次發(fā)現(xiàn)了噬菌體合成的用以抑制細菌體內(nèi)CRISPR-CAS系統(tǒng)的蛋白質(zhì)。 在這項研究中，研究人員利用生化和體內(nèi)研究方法對噬菌體產(chǎn)生的三種抗CRISPR蛋白進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每一種蛋白質(zhì)都通過不同的機制抑制CRISPR-CAS活性。其中兩種蛋白通過與CRISPR-CAS復合體內(nèi)的不同蛋白亞基發(fā)生相互作用，利用空間或非空間抑制效應阻斷CRISPR-CAS復合體的DNA結(jié)合活性。而第三種抗CRISPR蛋白則通過與CAS3解旋酶－核酸酶結(jié)合，阻止其被招募到與DNA結(jié)合的CRISPR-CAS復合體上。
研究人員利用體內(nèi)實驗證明抗CRISPR能夠?qū)RISPR-CAS系統(tǒng)轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋�轉(zhuǎn)錄抑制因子，首次提出了通過蛋白結(jié)合調(diào)節(jié)CRISPR-CAS活性的模型。
這些抗CRISPR蛋白的多樣性序列和作用機制代表它們具有各自獨立的進化過程，同時提示可能還會存在其他可能調(diào)控CRISPR-CAS功能的蛋白，仍然需要更多研究進行深入探討。
2. Cell：贊！又發(fā)現(xiàn)兩種新的抗CRISPR蛋白
doi:10.1016/j.cell.2016.12.009
在剛剛發(fā)現(xiàn)幾種能夠阻斷人細胞中的CRISPR-Cas9活性的蛋白（Cell, doi:10.1016/j.cell.2016.11.017）之后，來自美國加州大學舊金山分校的Joseph Bondy-Denomy和同事們在一項新的研究中報道了更多的抗CRISPR蛋白（anti-CRISPR）。
研究人員先假設細菌基因組可能含有一種抑制劑來阻止CRISPR切割其自身基因組中的靶標，然后通過在細菌基因組中尋找CRISPR序列和它的靶標而發(fā)現(xiàn)這些Cas9抑制劑。確實，Rauch和同事們揭示出幾種存在于李斯特菌中的抗CRISPR蛋白，而且這些抗CRISPR蛋白的序列是之前的噬菌體感染中遺留在李斯特菌基因組中的。Rauch說，“正如CRISPR技術是基于細菌的天然抗病毒防御系統(tǒng)開發(fā)出來的，我們也能夠利用病毒制造出的抗CRISPR蛋白來繞過這些細菌防御系統(tǒng)�！�
這項研究發(fā)現(xiàn)兩種蛋白抑制劑AcrIIA2和AcrIIA4阻斷來自釀膿鏈球菌的Cas9酶活性，其中Cas9是一種經(jīng)常用于基因組編輯中的DNA切割酶。
3.Nat Microbiol：微生物利用抗CRISPR蛋白破壞CRISPR/Cas系統(tǒng)
doi:10.1038/nmicrobiol.2016.85
在一項新的研究中，來自加拿大多倫多大學和新西蘭奧塔哥大學的一個研究團隊發(fā)現(xiàn)多樣性的細菌物種編碼阻斷特異性CRISPR/Cas系統(tǒng)活性的基因。通過掃描原噬菌體（即整合在細菌基因組中的噬菌體基因組），來自多倫多大學的Alan Davidson和同事們鑒定出5種新的抗CRISPR蛋白編碼基因，而在此之前，他的團隊已鑒定出9種。這項最新的研究突出強調(diào)了一種學習CRISPR系統(tǒng)如何工作的方法以及一種潛在的開展基于CRISPR的基因編輯的附加工具。相關研究結(jié)果于2016年6月13日在線發(fā)表在Nature Microbiology期刊上，論文標題為“Inactivation of CRISPR-Cas systems by anti-CRISPR proteins in diverse bacterial species”。
在當前的這項研究中，Davidson團隊擴大對變形菌門（Proteobacteria）內(nèi)細菌物種基因組的搜尋。鑒于之前鑒定出的這9種蛋白沒有共同的序列基序，研究人員尋找與一種假定的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因具有同源性的序列，這是因為他們發(fā)現(xiàn)這種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因位于所有已知的抗CRISPR位點的附近。
Davidson和同事們?nèi)缓鬁y試了在質(zhì)粒中表達的每種假定的抗CRISPR基因是否能夠支持噬菌體在攜帶靶向它的I-E型或I-F型CRISPR系統(tǒng)的細菌內(nèi)復制。他們又鑒定出4種靶向作用于I-F型CRISPR系統(tǒng)的抗CRISPR基因，以及一種能夠阻斷I-E型和I-F型CRISPR系統(tǒng)的抗CRISPR基因。
4.mBio：鑒定出新的一組抑制銅綠假單胞菌I-E型CRISPR-Cas系統(tǒng)的噬菌體抗CRISPR基因
doi:10.1128/mBio.00896-14
在一項新的研究中，多倫多大學的Alan Davidson團隊證實攜帶I-F型抗CRISPR基因的一些噬菌體介導對銅綠假單胞菌的I-E型CRISPR-Cas系統(tǒng)的抑制。這些基因并不抑制銅綠假單胞菌的I-F型CRISPR-Cas系統(tǒng)，也不抑制大腸桿菌的I-E型CRISPR-Cas系統(tǒng)他們也在銅綠假單胞菌的非前噬菌體基因組區(qū)域（可能是可移動的遺傳因子）中鑒定出功能性的抗CRISPR基因。
他們首次證實銅綠假單胞菌的I-E型CRISPR-Cas系統(tǒng)無需基因操縱就天然地具有活性，這與之前描述過的大腸桿菌和其他細菌的I-E型CRISPR-Cas系統(tǒng)形成鮮明對比。
5.Cell：重磅！揭示抗CRISPR蛋白阻斷CRISPR系統(tǒng)機制
doi:10.1016/j.cell.2017.03.012
如今，來自美國國家過敏癥與傳染病研究所、斯克里普斯研究所、蒙大拿州立大學、加州大學舊金山分校和加拿大多倫多大學的研究人員首次解析出病毒抗CRISPR蛋白附著到一種細菌CRISPR監(jiān)視復合物上時的結(jié)構。他們發(fā)現(xiàn)抗CRISPR蛋白的作用機制是封鎖CRISPR識別和攻擊病毒基因組的能力。一種抗CRISPR蛋白甚至“模擬”DNA，讓這種crRNA（CRISPR經(jīng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA）引導的檢測機器脫軌。相關研究結(jié)果發(fā)表在2017年3月23日的Cell期刊上，論文標題為“Structure Reveals Mechanisms of Viral Suppressors that Intercept a CRISPR RNA-Guided Surveillance Complex”。論文通信作者為來自斯克里普斯研究所的Gabriel C. Lander和來自蒙大拿州立大學的Blake Wiedenheft。
利用一種被稱作冷凍電鏡的高分辨率成像技術，這些研究人員發(fā)現(xiàn)了CRISPR系統(tǒng)和抗CRISPR蛋白的三個重要的方面。
首先，他們準確地觀察這種CRISPR監(jiān)視復合物如何識別病毒遺傳物質(zhì)以便發(fā)現(xiàn)它應當在何處發(fā)起攻擊。這種監(jiān)視復合物中的蛋白像握手那樣纏繞在細菌crRNA的周圍，讓這種crRNA的特定片段暴露出來。這種特定片段掃描病毒DNA，尋找它們能夠識別的基因序列。再者，這些研究人員分析了病毒抗CRISPR蛋白如何癱瘓這種監(jiān)視復合物。他們發(fā)現(xiàn)一種抗CRISPR蛋白覆蓋住crRNA的這個暴露片段，從而阻止這種CRISPR系統(tǒng)掃描病毒DNA。
另一種抗CRISPR蛋白采用一種不同的策略�；谶@種抗CRISPR蛋白的結(jié)合位置和負電荷，這些研究人員認為它起著模擬DNA的作用，誘導CRISPR結(jié)合這種抗CRISPR蛋白，而不是入侵的病毒DNA。
這些研究人員認為這種對抗CRISPR蛋白的新認識可能最終導致人們開發(fā)出更加復雜的和更加高效的基因編輯工具�？笴RISPR蛋白可能能夠被用于CRISPR系統(tǒng)之中來迅速阻斷基因編輯，或者科學家們可能能夠降解抗CRISPR蛋白來觸發(fā)基因編輯。
6.Science子刊：利用抗CRISPR蛋白顯著降低CRISPR-Cas9脫靶效應
doi:10.1126/sciadv.1701620
如今有研究證實病毒進化出的反制措施，即被稱作抗CRISPR蛋白（anti-CRISPR）的抑制性蛋白，能夠被用來改進作為一種基因治療工具的CRISPR-Cas9，從而降低可能導致不良副作用的脫靶基因編輯。
在一項新的研究中，來自美國加州大學伯克利分校和加州大學舊金山分校的研究人員證實最近發(fā)現(xiàn)的抗CRISPR蛋白降低脫靶效應多達4倍，就像一種切斷開關那樣讓CRISPR-Cas9完成它的任務之后失去功能。相關研究結(jié)果發(fā)表在2017年7月12日的Science Advances期刊上，論文標題為“Disabling Cas9 by an anti-CRISPR DNA mimic”。論文通信作者為加州大學伯克利分校創(chuàng)新基因組學研究所研究員Jacob Corn博士和來自加州大學伯克利分校的作為CRISPR-Cas9基因編輯發(fā)明人之一的Jennifer A. Doudna。
在這項研究中，這些研究人員讓CRISPR-Cas9分子利用向?qū)NA（gRNA）發(fā)現(xiàn)、切割和替換導致鐮狀細胞疾病的血紅蛋白編碼基因突變體。他們證實一種被稱作AcrIIA4的特定抗CRISPR蛋白將這種CRISPR-Cas9分子的脫靶效應降低4倍。它在做到這一點的同時不會顯著地降低想要的在靶基因編輯。
7.Nature子刊：浙江大學朱永群實驗室揭示AcrF3蛋白抑制病原菌I型CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)的分子機制
doi:10.1038/nsmb.3269
AcrF3-PaCas3復合物晶體結(jié)構示意圖
2016年7月25日，國際學術權威刊物自然出版集團旗下子刊《Nature Structural & Molecular Biology》雜志上在線發(fā)表了浙江大學生命科學研究院朱永群實驗室題為“Structural Basis for Cas3 Inhibition by the Bacteriophage Protein AcrF3”的研究論文，研究揭示噬菌體蛋白AcrF3抑制病原菌I型CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)效應分子Cas3的分子機理。國家蛋白質(zhì)科學中心的姚德強博士和朱永群實驗室博士生王小飛為論文共同第一作者，朱永群教授和助理研究員周艷博士為本文的共同通訊作者。
朱永群實驗室建立了PaCas3體外核酸酶酶學實驗體系，發(fā)現(xiàn)PaCas3具有很好的多種二價金屬離子依賴的核酸酶活性。進一步的生化實驗揭示AcrF3蛋白在溶液狀態(tài)下形成同源二聚體分子，以高親和力的方式與PaCas3特異地結(jié)合，有效地抑制了PaCas3體外核酸酶活性。通過解析2.6埃高分辨率的PaCas3-AcrF3復合物的晶體結(jié)構，該研究發(fā)現(xiàn)PaCas3由一個獨立的N端Cas2結(jié)構域、HD型核酸酶結(jié)構域、SF2型解旋酶結(jié)構域(由RecA1和RecA2兩個亞結(jié)構域組成)、Long linker區(qū)以及C端結(jié)構域(CTD)所構成。單獨的Cas2蛋白被報道在CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)的DNA adaptation(DNA適應)過程中發(fā)揮關鍵作用，Cas2與Cas1形成摩爾比2：4的整合酶復合物，將獲取的外源DNA插入CRISPR基因座中。PaCas3擁有獨立的Cas2結(jié)構域，說明PaCas3不同于以往報道的Cas3分子，它同時參與了CRISPR-Cas系統(tǒng)中的DNA適應和DNA干擾兩個過程。
在PaCas3-AcrF3復合物晶體結(jié)構中，AcrF3以同源二聚體的方式與PaCas3的緊密結(jié)合，這與我們的生化實驗結(jié)果完全一致。單個AcrF3分子呈現(xiàn)由六股α-螺旋組成的雙層結(jié)構，并通過疏水相互作用、以反向?qū)ΨQ的方式形成同源二聚體分子。破壞二聚體中兩個分子之間的疏水作用，將導致AcrF3完全喪失了抑制PaCas3體外核酸酶活性的能力。在復合物結(jié)構中，AcrF3二聚體結(jié)合在PaCas3 的位于Long linker區(qū)與CTD結(jié)構域之間的凹槽區(qū)域，并與PaCas3的HD、Long linker區(qū)、RecA2和CTD結(jié)構域之間發(fā)生了廣泛的相互作用。其中，AcrF3與RecA2之間的相互作用完全封閉了PaCas3解旋酶結(jié)構域中DNA結(jié)合通道的入口，說明AcrF3的結(jié)合導致PaCas3不能接觸由Cascade呈遞來的目標DNA。令人驚訝的是，在復合物結(jié)構中，PaCas3解旋酶結(jié)構域結(jié)合了一個ADP分子，而不是通�；钚越庑附Y(jié)合的ATP分子，表明AcrF3將PaCas3鎖定在非活性的狀態(tài)。通過進一步的結(jié)構分析，該研究還發(fā)現(xiàn)AcrF3也阻止了Cascade復合物的Cse1亞基對PaCas3的識別作用，導致Cascade不能招募PaCas3。因此，AcrF3蛋白以同源二聚體為活性單元，通過屏蔽PaCas3對目標DNA的接觸、阻斷Cascade復合物Cse1亞基對PaCas3的招募作用以及將PaCas3鎖定在ADP結(jié)合的非活性狀態(tài)，從而抑制I型CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)，發(fā)揮其anti-CRISPR活性。
8.Nature：發(fā)現(xiàn)讓細菌中的CRISPR/Cas系統(tǒng)失活的噬菌體基因
doi:10.1038/nature11723
在一項新的研究中，多倫多大學的Alan Davidson團隊在一項研究中，發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）基因組中的單個原噬菌體能夠抵抗一系列其他類型的噬菌體。因此，他們對銅綠假單胞菌CRISPR系統(tǒng)進行調(diào)整以便試圖理解這種原噬菌體如何可能影響這種細菌對噬菌體感染的敏感性。他們發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌的I-F型CRISPR系統(tǒng)僅僅阻止某些類型的噬菌體的感染。通過搜尋噬菌體基因組，他們發(fā)現(xiàn)5種獨特的基因，每種都有抗CRISPR活性。
9.哈工大黃志偉課題組最新Nature！揭示魔剪CRISPR“抑制開關”分子機制
doi:10.1038/nature22377
4 月 28 日，哈爾濱工業(yè)大學生命學院黃志偉教授課題組在《自然》（《Nature》）在線發(fā)表了題目為《Anti-CRISPR 蛋白抑制 CRISPR-SpyCas9 活性的分子機制》（Structural basis of CRISPR-SpyCas9 inhibition by an anti-CRISPR protein）的研究論文。
早先的研究發(fā)現(xiàn)一類來自于 Listeria monocytogenes 前噬菌體的 Anti-CRISPR 基因 AcrIIA4 等在細胞內(nèi)能夠抑制 SpyCas9 的基因編輯活性，然而這些 Anti-CRISPR 基因抑制 SpyCas9 活性的分子機制并不清楚。
為了研究 AcrIIA2 或 AcrIIA4 是否能夠直接結(jié)合 SpyCas9，課題組首先建立體外生物化學研究系統(tǒng)，研究發(fā)現(xiàn) Anti-CRISPR 蛋白 AcrIIA2 或 AcrIIA4 直接結(jié)合 SpyCas9-sgRNA 復合物，有趣的是 AcrIIA2 或 AcrIIA4 只和結(jié)合有 sgRNA 的 SpyCas9 有相互作用，而和單獨 SpyCas9 并沒有相互作用；進一步實驗發(fā)現(xiàn) AcrIIA2 或 AcrIIA4 能夠直接抑制 SpyCas9 介導的目的 DNA 的剪切。
為了研究 AcrIIA4 直接抑制 SpyCas9 活性的分子機制，課題組純化出 SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4 復合物，并通過結(jié)構生物學研究方法解析了 SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4 復合物的晶體結(jié)構，該復合物結(jié)構揭示 AcrIIA4 蛋白構象是一個新的折疊，它結(jié)合在 SpyCas9 的 CTD、TOPO 和 RuvC 三個結(jié)構域形成的凹槽區(qū)域。該凹槽區(qū)域正是 SpyCas9 上的底物 PAM DNA 的結(jié)合位點；另外來自 AcrIIA4 的β1 折疊片前的 Loop 與 RuvC 活性位點接觸也加強了 AcrIIA4 對 SpyCas9 的抑制作用。上述結(jié)構觀察結(jié)果顯示 AcrIIA4 和底物 PAM DNA 競爭性結(jié)合 SpyCas9，AcrIIA4 比底物 PAM DNA 具有更強的親和力的實驗結(jié)果進一步支持了結(jié)構觀察的結(jié)果。接下來的生化實驗結(jié)果進一步證實 AcrIIA4 結(jié)合 SpyCas9 后抑制底物 PAM DNA 結(jié)合 SpyCas9，從而拮抗 SpyCas9 的活性。
10.Cell：首次發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9基因編輯的“關閉開關”
doi:10.1016/j.cell.2016.11.017
CRISPR/Cas9基因組編輯正快速地引發(fā)生物醫(yī)學研究變革，但是這種新技術迄今為止并不是非常精確的。這種技術能夠在基因組中無意地產(chǎn)生過多的或者不想要的變化，產(chǎn)生脫靶突變，從而限制了它在治療應用中的安全性和療效。
如今，在一項新的研究中，來自美國馬薩諸塞大學醫(yī)學院和加拿大多倫多大學的研究人員發(fā)現(xiàn)首批已知的CRISPR/Cas9活性“關閉開關”，從而為CRISPR/Cas9編輯提供更好的控制。
馬薩諸塞大學醫(yī)學院RNA治療研究所教授Erik J. Sontheimer博士、多倫多大學分子遺傳學教授Alan Davidson博士和多倫多大學生物化學助理教授Karen Maxwell博士鑒定出三種自然產(chǎn)生的抑制Cas9核酸酶的蛋白。這些被稱作抗CRISPR的蛋白具有阻斷Cas9切割DNA的能力
