使用串聯(lián)切向流過濾高效濃縮慢病毒載體
簡介
VSV-G-假型自我滅活慢病毒載體是不可或缺的生物實驗工具之一，與之前的γ-逆轉錄病毒載體不同的是，慢病毒載體可轉導非分裂細胞，并可攜帶更多的轉基因盒，在細胞中的轉基因表達時間也更長，即可獲得更高的滴度，而其遺傳毒性相對較低。
一般情況下產(chǎn)毒細胞上清液中的載體滴度足以轉導常規(guī)細胞系，但原代細胞較難轉導，需要進行載體濃縮以獲得較高濃度。此外，一些載體因整合了會降低滴度的遺傳元件，且大多數(shù)細胞類型也不耐受產(chǎn)毒細胞生長培養(yǎng)基或其分泌蛋白，所以濃縮及清洗是慢病毒載體使用的必要步驟。
超速離心是病毒顆粒濃縮的常用方法之一，但其濃縮系數(shù)較低，每次處理量也偏小，且繁瑣的多步操作會降低病毒顆粒回收率。離心過濾是相對較簡單的濃縮方法，但過濾器本身會捕獲截留大量載體，造成損耗。相較而言，切向流過濾（TFF）操作簡單，損耗低，且可通過洗濾過程有效降低產(chǎn)毒細胞代謝物及分泌蛋白，但傳統(tǒng)的一步式TFF濃縮程度僅可達50-100倍，本實驗使用兩步TFF，成功將5.5L 慢病毒載體原液濃縮至1mL左右，且回收率高達97%以上。而對終產(chǎn)物的質量分析顯示，濃縮的慢病毒載體可有效轉導原代人CD34+造血干/祖細胞和原代人纖維母細胞，且無明顯毒性。
實驗
實驗使用含pCCL載體質粒、gag/pol表達質粒及囊膜表達質粒pMD.G（VSV-G）的轉染混合液轉染293T細胞，并于轉染后進行丁酸鈉誘導，培養(yǎng)一定時間后，分兩次回收含LV培養(yǎng)基，過0.8μm過濾器，濾液保存于無菌容器。
切向流過濾使用KrosFlo研發(fā)用IIi切向流過濾系統(tǒng)（產(chǎn)品編號：SYR2-U20-01N），第一步操作時，系統(tǒng)配用流路1（FP1，產(chǎn)品編號：EZ-M1-500S-260-01N-1，含500kD中空纖維過濾器（纖維數(shù)量320，纖維內徑0.5mm，膜表面積615cm2）），第二步操作時，系統(tǒng)配用流路2（FP2，產(chǎn)品編號：EZ-CHIL07-01-1，含500kD中空纖維過濾器（纖維數(shù)量12，纖維內徑0.5mm，膜表面積40cm2）。
過濾前先檢查流路（FP1）完整性，用DPBS完全潤濕流路后，運行系統(tǒng)，直到DPBS排干，關閉端口和閥門，運行泵，直到入口壓力達到5psi左右，打開濾液端口，由于空氣不能滲過潤濕的過濾器纖維，如組件完整，則壓力降不應超過0.01psi/s。
通過完整性測試后，開始濃縮含LV培養(yǎng)基。整個過程中，監(jiān)測入口壓力，并維持為6psi以下。第一步操作可將5.5L料液濃縮至50mL，即濃縮100倍左右。濃縮的載體再用1000mL含胎牛血清的洗濾緩沖液進行恒量洗濾。之后，將系統(tǒng)流路更換為FP2，通過完整性測試后，將第一步獲得的50mL濃縮液進一步濃縮至1mL，即總濃縮達5000倍。該步入口壓力維持為9psi以下
隨后，通過HT-29細胞載體轉導實驗確認滴度，并使用多重實時PCR技術進行絕對定量分析。同時，以終濃度載體轉導原代人CD34+造血干/祖細胞，確認濃縮后載體的轉導效力。此外，構建針對誘導多能性干細胞（iPSC）生成的復合STEMCCA 載體，以相同的方法進行濃縮，檢測其轉導和重編程原代人纖維母細胞的能力。
結果
使用TFF進行LV濃縮可獲得極高的濃縮系數(shù)和回收率，且對濃縮后LV的凍融實驗顯示，終產(chǎn)物具有良好的穩(wěn)定性。
為測試濃縮LV的質量，進行了原代人CD34+造血干/祖細胞的轉導實驗，結果顯示，轉導非常成功，且隨載體濃度的增加，轉導成功率亦明顯上升，而無明顯毒性。而在原代人纖維母細胞轉導實驗中，含有高效STEMCCA元件的載體可有效轉導并重編程原代人纖維母細胞，形成誘導多能性干細胞，且成功率隨載體濃度增加而提高。
討論
使用兩步切向流過濾可以高倍數(shù)、高回收率地濃縮LV，工藝穩(wěn)定，重復性好。針對CD34+的轉導和表達實驗表明濃縮后產(chǎn)物無明顯毒性，而高濃度STEMCCA載體制備及誘導實驗證明，該工藝可用于大規(guī)模復雜載體的生產(chǎn)和濃縮。
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原文：Cooper,A.R., Patel,S., Senadheera, S., et al., Highly efficient large-scale vector concentration by tandem tangential flow filtration. Journal of Virological Methods, 2011, 177: 1-9.
KrosFlo Research 2i [KR2i] 切向流過濾系統(tǒng)
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