切向流超濾：膠乳銀納米顆粒粒徑篩選和濃縮的“綠色”技術(shù)

​銀納米顆粒（AgNP）因其抗菌特性，廣泛應(yīng)用于消費(fèi)品、水體消毒劑、治療藥物以及生物醫(yī)學(xué)設(shè)備的生產(chǎn)，但其適用性受粒徑限制。對(duì)均質(zhì)AgNP進(jìn)行粒徑控制，并消除穩(wěn)定劑及有機(jī)溶劑的毒性影響，在技術(shù)和效率上都存在諸多挑戰(zhàn)。

切向流超濾（TFU）常用于蛋白質(zhì)、病毒和細(xì)胞的分離，是一項(xiàng)“再循環(huán)”的技術(shù)，簡(jiǎn)單來(lái)講，就是料液通過(guò)孔徑10kD-1000kD的一系列中空纖維膜，樣品中較小的懸浮或溶解成分會(huì)與溶劑（濾液）一起通過(guò)多孔性屏障，而較大的成分被截留（回流液）。TFU既不會(huì)損壞樣品，也不需要添加額外的溶劑以去除過(guò)量的毒性試劑或副產(chǎn)物，所以可以認(rèn)為是一種“綠色”的技術(shù)。通過(guò)TFU可對(duì)AgNP粒徑、濃度和聚集狀態(tài)起到很好的選擇性控制，且相對(duì)超速離心更加方便。

操作步驟：

按Creighton法合成4L膠乳AgNP，UV-Vis分光光度法和拉曼光譜法檢測(cè)膠乳顆粒形狀、粒徑分布、聚集狀態(tài)和純度。

KrosFlo Research 2i [KR2i] 切向流過(guò)濾系統(tǒng)

使用KrosFlo研發(fā)用IIi切向流超濾系統(tǒng)對(duì)膠乳AgNP進(jìn)行粒徑篩選和濃縮,分三步操作進(jìn)行：

第一步：

1) 通過(guò)軟管接頭將MasterFlex #17進(jìn)樣軟管連接到蠕動(dòng)泵。然后將軟管與50nm MidiKros組件連接。用扎帶緊固連接以保證密封。將監(jiān)測(cè)器控制界面的軟管尺寸選為17。

2) 將泵運(yùn)行方向設(shè)置為逆時(shí)針運(yùn)行。

3) 將泵速降低至300ml/min以下，運(yùn)行泵。泵速需根據(jù)使用的軟管進(jìn)行調(diào)整。開(kāi)始泵的運(yùn)行速度應(yīng)盡量小，以避免發(fā)生大的泄漏，但也應(yīng)能足以使液流充滿整個(gè)系統(tǒng)。管路連接需確保能達(dá)到足夠的真空，以便從容器內(nèi)吸取膠乳進(jìn)入管路和過(guò)濾器，可將過(guò)濾器底部的軟管連接至軟管中部Y型接頭的頂部。

4) 將過(guò)濾器出口的軟管置于容器內(nèi)，用彈簧夾夾閉軟管底部，開(kāi)始泵運(yùn)行。管路內(nèi)形成的真空開(kāi)始虹吸膠乳。

5) 當(dāng)液體開(kāi)始自由通過(guò)管路，停止泵運(yùn)行，用軟管接頭加入管路的斷口部分，用扎帶密封。打開(kāi)泵運(yùn)行。

6) 檢查管路循環(huán)是否有泄漏。如果發(fā)現(xiàn)泄漏，調(diào)整接頭或重新扎緊扎帶以密封。確認(rèn)管路密封后，可開(kāi)始增加泵速，直到達(dá)到所選軟管的最佳耐受泵速。繼續(xù)過(guò)濾，直到容器瓶?jī)?nèi)的液體排空。

7) 過(guò)濾完成后，收集含有粒徑50nm及以下AgNP的濾液。也可保留回流液，以進(jìn)行確認(rèn)測(cè)試。

第一步TFU使用50nm過(guò)濾器（11500px2）進(jìn)行粒徑篩選，去除膠乳原液中50nm及以上的AgNP和AgNP聚集體。這一步也產(chǎn)生了少量的濃縮，最終得到3.9L 50nm濾液。

第二步：

8) 用2%的HNO3和超純水沖洗管路，按之前的步驟安裝100kD的MidiKros過(guò)濾器。

9) 使用100kD的MidiKros組件重復(fù)步驟3）。

10) 過(guò)濾完成后，收集回流液（包括管路和過(guò)濾器內(nèi)液體）。體積約為50ml。

第二步進(jìn)行了較大規(guī)模的濃縮，將上一步的濾液過(guò)100kD過(guò)濾器（200cm²）。最后得到50ml回流液。

第三步：

11) 將MasterFlex #14軟管和100kD MicroKros 過(guò)濾器連接到蠕動(dòng)泵，用扎帶密封所有連接。將控制界面的軟管尺寸選為14，將泵速調(diào)低為30 ml/min。

12) 開(kāi)始過(guò)濾操作。檢查循環(huán)回路是否有泄漏。如果發(fā)現(xiàn)泄漏，調(diào)整接頭或重新扎緊扎帶以密封。

13) 確認(rèn)管路密封后，調(diào)節(jié)泵速不高于90ml/min。

14) 過(guò)濾完成后，將管路和過(guò)濾器內(nèi)殘余的料液排出，停止泵運(yùn)行。

在第三步中，對(duì)AgNP進(jìn)行了進(jìn)一步的濃縮，使用表面積更�。�50cm²）的100kD過(guò)濾器，將體積降為4.0ml。

3. 使用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICP-OES）對(duì)膠乳AgNP中的銀含量進(jìn)行定量檢測(cè)，AgNP產(chǎn)量基本沒(méi)有損耗。

使用透射電鏡觀察膠乳AgNP的粒徑分布，最終的100kD回流液中基本為粒徑1-20nm的無(wú)聚集AgNP。

TFU工藝流程圖。藍(lán)色方框內(nèi)為采集樣品進(jìn)行進(jìn)一步分析的AgNP膠乳懸液。小瓶中樣品分別為A）原始膠乳樣品，B）原始膠乳經(jīng)50nm過(guò)濾器（460cm²）處理后收集的50nm濾液， C）使用100kD MidiKros 過(guò)濾器（200cm²）降低體積后收集的第一次100kD回流液，D）使用100kD MicroKros 過(guò)濾器（20cm²）降低體積后收集的最終100kD回流液。100kD濾液外觀接近水。

結(jié)論：

TFU是進(jìn)行膠乳AgNP粒徑篩選和濃縮的高效、“綠色”技術(shù)，且可維持極低的顆粒聚集。因?yàn)樵谔幚磉^(guò)程中去除了AgNP合成所使用的化學(xué)毒性試劑及有機(jī)溶劑，并降低了AgNP的粒徑分散度，其催化特性、光電特性、生物傳感特性及納米毒性均可改善，促進(jìn)了其在醫(yī)學(xué)、工業(yè)及科研領(lǐng)域的應(yīng)用。

在實(shí)際應(yīng)用中，可選擇其它規(guī)格過(guò)濾器對(duì)TFU工藝進(jìn)行優(yōu)化（過(guò)濾器孔徑范圍10kD-1000kD，膜表面積5.1m2-200px2，疏水性或親水性），而監(jiān)測(cè)工藝壓力或適當(dāng)清洗，可提高過(guò)濾器使用壽命。顆粒的電荷特性也會(huì)影響超濾工藝的進(jìn)行。此外，也可根據(jù)下游應(yīng)用需求，使用TFU進(jìn)行緩沖液置換等操作。

但需注意的是，如果濃縮倍數(shù)過(guò)高，可能會(huì)降低膠乳懸液的穩(wěn)定性和保存期限。在10℃條件下，高度濃縮的未功能化AgNP的保存期限約為一到兩周。可根據(jù)實(shí)際情況，調(diào)整制備和處理工藝參數(shù)，提高產(chǎn)品穩(wěn)定性和保存期限。

本文內(nèi)容為編者翻譯，如有不當(dāng)之處，敬請(qǐng)諒解，詳細(xì)內(nèi)容，請(qǐng)參考原文。

原文：Anders,C.B., et al.. Tangential Flow Ultrafiltration: A “Green” Method for the SizeSelection and Concentration of Colloidal Silver Nanoparticles. Journal ofVisualized Experiments. 2012.68.

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