連續(xù)洗濾純化均質(zhì)膠乳顆�！�—快速清除膠乳顆粒中過量游離蛋白

簡(jiǎn)介：

體外診斷試劑使用的微/納米膠乳顆粒通常需要在蛋白（如抗體、抗原、核酸或其它大分子）包被反應(yīng)之前或之后進(jìn)行清洗，特別是在使用過量抗體進(jìn)行被動(dòng)吸附或共價(jià)偶聯(lián)之后，多余的游離抗體必須清除，以保證可信的測(cè)試結(jié)果和最佳的靈敏度。本文簡(jiǎn)述了通過定量洗濾從乳膠顆粒中快速、有效去除游離蛋白的方法。

背景：

瞬時(shí)膜截留率定義為：

膜截留百分比 = r = 1-（Cf/Cr）

其中，Cf為透過膜的濾液中可溶性成分的濃度，Cr為從膜組件出口回流的溶液濃度。如果膜允許溶質(zhì)自由通過，膜兩側(cè)的濃度相同，則截留百分比為0。如果膜完全截留一種溶質(zhì)，則濾液中的濃度為0，膜截留百分比為1或100%。我們假設(shè)膜對(duì)膠乳顆粒的截留百分比為100%，而對(duì)游離蛋白的截留百分比接近0。所以，在恒定體積洗濾中，膠乳顆粒的濃度保持恒定，而游離蛋白滲透通過膜。游離蛋白的濃度可由以下公式計(jì)算：

濃度 = Co· e – v (1-r)

其中，v為洗濾的體積，r為溶質(zhì)的截留百分比，Co為游離蛋白的起始濃度。如果蛋白的膜截留百分比為0，每體積洗濾后有63.2%通過進(jìn)入濾液。

工藝條件：

起始處理為200ml 的50mM tris 緩沖液，其中20ml（10%）直徑 0.255μm 的聚苯乙烯膠乳顆粒（Seradyn lot 1057），吸附2.5%牛血清白蛋白（BSA）。使用 KrosFlo^® 系統(tǒng)，配用單根孔徑0.1μm的MiniKros^® Sampler組件，膜表面積為945cm²。顆粒溶液恒定速度循環(huán)，濾液端口在整個(gè)運(yùn)行過程中都打開。起始進(jìn)樣壓力為10 psig，并保持恒定。50mM tris 緩沖溶液以與濾液移除相同的速率加入到工藝容器，這樣，即可維持恒定的200 ml 處理體積。14min內(nèi)收集濾液體積2,500 ml （樣品體積的12.5倍）。

KrosFlo Research 2i [KR2i] 切向流過濾系統(tǒng)

結(jié)果：

濾液中白蛋白的濃度使用BCA法測(cè)定。結(jié)果顯示，與乳膠顆粒膜截留百分比為1而蛋白膜截留百分比為0的理想情況只有輕微偏差。游離BSA被快速清除，超過99.99%。在濾液中沒有檢測(cè)到乳膠顆粒，且吸附BSA的損失遠(yuǎn)沒有達(dá)到可檢測(cè)量。過濾效率保持相對(duì)恒定。

討論：

使用MiniKros^®和更大的 KrosFlo^® 過濾組件進(jìn)行恒定體積洗濾，是繁瑣的離心/懸浮操作快速、高效的替換方法。同時(shí)，也可有效地在共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)之前去除表面活性劑和水溶性單體，顯著節(jié)約時(shí)間和勞動(dòng)力成本。瑞普利金中空纖維組件與需重復(fù)清洗的過濾設(shè)備相比，具有諸多優(yōu)勢(shì)。組件無表面活性劑，即取即用，蛋白截留不受清洗和多次重復(fù)使用的影響。

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