噬菌體展示技術(shù)常見問題與解答

1、在噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用中，M13噬菌體與其他噬菌體比有什么優(yōu)點(diǎn)？
  M13噬菌體和與其密切相關(guān)的絲狀噬菌體fd和f1均為非裂解性噬菌體，它們?cè)谠鲋称陂g均不裂解宿主菌。這就極大地簡(jiǎn)化了每輪淘選過程之間的中間噬菌體純化步驟，只用簡(jiǎn)單的PEG沉淀方法就足以將噬菌體與其他所有污染的細(xì)胞蛋白分開。而其他用于噬菌體展示的噬菌體，如T7, T4和Lambda噬菌體，均為裂解性噬菌體，每輪淘選之間都需要花時(shí)間進(jìn)行純化，以避免淘選擴(kuò)增的噬菌體污染有細(xì)胞蛋白。

2、pIII蛋白展示和pVIII蛋白展示有什么不同?
  絲狀噬菌體展示系統(tǒng)一般是在包膜蛋白pIII或pVIII的N端融合外源多肽。每個(gè)病毒子含５個(gè)拷貝的pIII蛋白，這五個(gè)蛋白都可以融合短肽而不影響噬菌體的感染力。而對(duì)主要包膜蛋白pVIII來說，每個(gè)病毒子含～2700個(gè)拷貝之多，其中約10%能有效地融合外源多肽或蛋白。這樣，以pIII融合子方式表達(dá)的多肽便是低價(jià)的（每個(gè)病毒子1~5個(gè)拷貝），而以pVIII融合子方式表達(dá)的多肽則是高價(jià)的（每個(gè)病毒子~200個(gè)拷貝）。這種高價(jià)pVIII展示所增加的親和力／性有利于篩選到親和力非常低的配體，而低價(jià)pIII展示則將篩選限制在具有較高親和力的配體上。

3、含與不含前導(dǎo)肽的pIII蛋白各有多大？
  未加工的包膜蛋白pIII（含前導(dǎo)肽序列但不含展示肽的pIII蛋白）的分子量為44651 Da。不含前導(dǎo)肽序列的成熟pIII蛋白分子量為42579 Da。
然而，進(jìn)行SDS-PAGE電泳時(shí)，pIII通常跑在分子量60-65 KDa附近，可能是因?yàn)樵摰鞍撞煌�功能域之間含有特殊的甘氨酸富集的間隔區(qū)域。前導(dǎo)肽的氨基酸序列是MKKLLFAIPLVVPFYSHS （注意起始甲硫氨酸Met是由密碼子GTG編碼的）。

4、文庫(kù)克隆載體可以買到嗎？
  用來構(gòu)建所有這三種Ph.D.文庫(kù)的載體，M13KE，是可以購(gòu)買到的。M13KE是M13mp19的衍生株，其pIII基因的5’端構(gòu)建了限制性酶切位點(diǎn)，用戶可以將設(shè)計(jì)好的人工基因盒（synthetic cassette）插入此處構(gòu)建自己的肽庫(kù)。因?yàn)镸13KE是噬菌體，而不是噬菌粒載體，所以在已加工病毒子上的所有5個(gè)拷貝的pIII蛋白均攜帶有展示肽序列。另外，大于20-30個(gè)殘基的展示多肽會(huì)影響噬菌體的感染力，所以此載體僅適合展示短的多肽，而不能展示大的蛋白分子或cDNA文庫(kù)。

5、有anti-M13的抗體嗎?
  市面上有抗-M13的抗體，抗-M13的抗體為多克隆抗體，主要識(shí)別pVIII抗原。

6、可以對(duì)文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增以便多做幾輪淘選試驗(yàn)嗎?
  強(qiáng)烈建議不要對(duì)產(chǎn)品中所提供的原始文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增。因?yàn)轶w內(nèi)序列偏性現(xiàn)象很可能導(dǎo)致某些序列在擴(kuò)增后的文庫(kù)中所占比例大大降低，甚至完全缺失。所提供的文庫(kù)都是在連接后僅擴(kuò)增了一次，文庫(kù)所有的特征（代表性的測(cè)序數(shù)據(jù)，淘選數(shù)據(jù)等）都是在擴(kuò)增銷售貯存液的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，一旦進(jìn)行再擴(kuò)增，我們便不能保證每種文庫(kù)中所報(bào)道的氨基酸分布數(shù)據(jù)依然成立。