中空纖維測(cè)試法：抗腫瘤藥物體內(nèi)活性篩選

定義

中空纖維測(cè)試法（HFA）是一種快速的體內(nèi)分析技術(shù)，可用于評(píng)估藥物的細(xì)胞毒性效應(yīng)，而通過將人體腫瘤細(xì)胞封裝培養(yǎng)于中空纖維內(nèi)并植入裸鼠皮下或腹腔，即可以用于評(píng)估待測(cè)化合物的藥效。

特性

評(píng)估潛在抗腫瘤藥物的活性可通過多種體內(nèi)模型，包括異種移植、原位模型和HFA。HFA方法經(jīng)美國(guó)國(guó)家癌癥研究所（NCI）改良，已成為一種獨(dú)特的藥物研發(fā)體內(nèi)模型。HFA可在同一實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的2個(gè)不同部位評(píng)估抗腫瘤藥物對(duì)多個(gè)不同細(xì)胞系的效力。HFA使用具有良好生物相容性的半滲纖維膜，纖維內(nèi)腔可封裝腫瘤細(xì)胞，適用于不同組織源性和細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞。纖維采用聚偏氟乙烯（PVDF）材質(zhì)，內(nèi)徑0.5-1mm，長(zhǎng)2cm，截留分子量500,000Da。因此，可溶性生物活性物質(zhì)（如蛋白質(zhì)，包括腫瘤細(xì)胞或宿主所產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子）可透過纖維膜壁，而腫瘤細(xì)胞和宿主細(xì)胞不會(huì)直接相互接觸。纖維通常植入裸鼠，也可以植入大鼠或其它實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以用于抗腫瘤藥物的臨床前研究。一只小鼠最多可接受6種腫瘤細(xì)胞系植入，因而，可在同一實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上同時(shí)進(jìn)行多種細(xì)胞系的檢測(cè)。因?yàn)樗拗鞯拿庖呒?xì)胞不會(huì)滲入中空纖維內(nèi)腔引起免疫反應(yīng)而妨礙腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，所以纖維可用于植入到免疫功能不全或免疫功能完全的小鼠品系。纖維可植入腹腔（i.p.）或皮下（s.c.），所以經(jīng)靜脈（i.v.）、口腔、i.p.及s.c.給藥有助于評(píng)估肝通過效果，為進(jìn)一步的細(xì)胞毒性和抗血管形成化學(xué)治療體內(nèi)測(cè)試提供給藥劑量、給藥周期的評(píng)估信息。給藥處理完成后，可研究分析活細(xì)胞增殖和細(xì)胞特性，包括細(xì)胞周期分布、DNA損壞誘導(dǎo)、細(xì)胞死亡誘導(dǎo)（凋亡）、蛋白質(zhì)表達(dá)水平以及細(xì)胞形態(tài)等。此外，也可以分析體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，包括藥物運(yùn)輸、pH、pO2。

NCI推薦12個(gè)腫瘤細(xì)胞系用于常規(guī)抗腫瘤藥物活性中空纖維篩選檢測(cè)。對(duì)于在體外抗腫瘤藥物篩選中已確認(rèn)有可重復(fù)活性的藥物，這可作為確定藥物潛在活性的初步體內(nèi)評(píng)估。HFA有助于選擇可優(yōu)先用于進(jìn)一步移植瘤模型篩選的化合物，大大減少直接進(jìn)行移植瘤檢測(cè)所需活性化合物的用量。NCI HFA檢測(cè)一種化合物對(duì)12個(gè)腫瘤細(xì)胞系的作用只需要24只小鼠，而在NCI移植瘤模型中，一種化合物對(duì)應(yīng)一種移植瘤模型，整個(gè)實(shí)驗(yàn)約需要50只小鼠。使用HFA進(jìn)行早期臨床前藥物篩選，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替換、改善、優(yōu)化（3R）的原則，有助于控制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用。

自其成功開發(fā)以來，已有多個(gè)科研小組通過HFA進(jìn)行藥物活性篩選。HFA已成功用于化合物對(duì)原始人體腫瘤細(xì)胞以及定性腫瘤細(xì)胞系效力的研究。HFA體內(nèi)分析不僅可成功用于抗腫瘤活性的定量研究，其應(yīng)用也在不斷得到擴(kuò)展。HFA已經(jīng)用于抗病毒藥物的評(píng)估，也適用于其它醫(yī)療領(lǐng)域。

體內(nèi)HFA可用于預(yù)測(cè)藥物對(duì)移植瘤的活性。在移植瘤模型中，抗腫瘤活性通常通過腫瘤體積的相對(duì)降低來確認(rèn)。而在HFA中，活性可通過活細(xì)胞數(shù)量的降低來確認(rèn)，后者可通過MTT分析來檢測(cè)。在移植瘤模型中具有活性的化合物通常在HFA中也具有活性。

移植瘤模型一般不能簡(jiǎn)單地闡釋化合物在腫瘤中作用機(jī)制。從移植瘤模型中收獲腫瘤細(xì)胞進(jìn)行藥效學(xué)研究通常由于宿主細(xì)胞的干擾而非常困難。生長(zhǎng)于中空纖維內(nèi)的細(xì)胞是獨(dú)立的細(xì)胞懸液，而無宿主細(xì)胞污染，可輕松地回收，用于機(jī)制研究。使用HFA進(jìn)行臨床前研究，可縮短將藥用化合物用于臨床研究的時(shí)間。但在某些情況下可能需要獲得更多關(guān)于腫瘤細(xì)胞-基質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)，這將是對(duì)HFA模型進(jìn)行優(yōu)化的新要求。

相比傳統(tǒng)動(dòng)物模型，HFA具有諸多優(yōu)勢(shì)。首先，HFA可以最短的時(shí)間（低于2周）和最少的材料（如待測(cè)化合物）得出藥效的定量指標(biāo)，而不會(huì)受到移植瘤模型大規(guī)模動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的成本限制。其次，在動(dòng)物模型中進(jìn)行研究需要大量的時(shí)間和精力進(jìn)行檢測(cè)操作，特別是當(dāng)待測(cè)化合物只具有極弱的抗腫瘤活性時(shí)。采用HFA，可免去在移植瘤模型中檢測(cè)無活性化合物的過程。第三，在組織培養(yǎng)研究中具有良好效果的腫瘤治療方式，在實(shí)體瘤中往往效果欠佳，原因可能是腫瘤在三維結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)過程中，其增殖性能和微環(huán)境異質(zhì)性會(huì)有差異，而細(xì)胞在中空纖維中可以三維結(jié)構(gòu)方式生長(zhǎng)。第四，這種檢測(cè)方法可將藥物的藥效動(dòng)力學(xué)以及潛在的生物轉(zhuǎn)化納入考量范圍。第五，HFA是進(jìn)行聯(lián)合用藥初步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的絕佳方法，因?yàn)榛�合物�?huì)有一個(gè)動(dòng)態(tài)的體內(nèi)相互作用過程。第六，HFA可以使實(shí)驗(yàn)小鼠免受移植瘤誘導(dǎo)的惡病質(zhì)影響。

HFA尚不能完全替代傳統(tǒng)的移植瘤模型。移植瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)以及與宿主組織的相互作用時(shí)復(fù)雜的反應(yīng)不能分析。細(xì)胞不能轉(zhuǎn)移到動(dòng)物的其它器官，因?yàn)槔w維防止了細(xì)胞的遷移。盡管使用纖維時(shí)不會(huì)誘導(dǎo)腫瘤血管的生成，新血管的形成仍可供給纖維營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這可能由纖維內(nèi)腫瘤細(xì)胞釋放的生長(zhǎng)因子所誘導(dǎo)。中空纖維可用于評(píng)估化合物到達(dá)不同生理部位（s.c.和i.p.）腫瘤細(xì)胞的能力，并評(píng)估藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)是否可以達(dá)到藥物活性濃度。使用現(xiàn)代生物發(fā)光技術(shù)，可觀察細(xì)胞在纖維內(nèi)的動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)過程。

方法

HFA可按以下步驟操作：從處于對(duì)數(shù)期的體外培養(yǎng)中按所需細(xì)胞密度收獲腫瘤細(xì)胞。將細(xì)胞懸液注入中空纖維，兩端熱密封，防止細(xì)胞流出。密度取決于待測(cè)細(xì)胞系，從1-100 X 10⁵ cells/fiber不等。植入宿主前，將纖維置于組織培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下孵育24-48hr。植入當(dāng)天，可使用MTT法對(duì)每個(gè)腫瘤細(xì)胞系樣品進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。纖維植入后數(shù)日，按所需劑量和周期給予實(shí)驗(yàn)小鼠抗腫瘤藥物處理，最長(zhǎng)可持續(xù)2周。給藥結(jié)束后，從宿主回收纖維，進(jìn)行MTT分析。計(jì)算每個(gè)細(xì)胞系的凈生長(zhǎng)百分比，與對(duì)照組凈生長(zhǎng)百分比比較。此外，也可以進(jìn)行其它細(xì)胞學(xué)分析。

參考文獻(xiàn)

1. Hollingshead MG, Alley MC, Camalier RF et al (1995) In vivo cultivation of tumor cells in hollow fibers. Life Sci 57:131–141

2. Suggitt M, Bibby MC (2005) 50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches.Clin Cancer Res 11:971–981

3. Decker S, Hollingshead M, Bonomi CA et al (2004) The hollow fibre model in cancer drug screening: the NCI experience.Eur J Cancer 40:821–826

4. Temmink OH, Prins HJ, van Gelderop E et al (2007) The hollow fibre assay as a model for in vivo pharmacodynamics of fluoropyrimidines in colon cancer cells. Br J Cancer 96:61–66

5. Suggitt M, Cooper PA, Shnyder SD et al (2006) The hollow fibre model – facilitating anti-cancer pre-clinical pharmacodynamics and improving animal welfare. Int J Oncol 29:1493–1499

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