透析制備中性膠原蛋白凝膠

簡介

在體內(nèi)，細(xì)胞存在于富含I型膠原蛋白的三維細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境內(nèi)，所以三維基質(zhì)是天然的組織工程學(xué)支架。水凝膠因具有與多數(shù)組織天然細(xì)胞外基質(zhì)相似的結(jié)構(gòu)和良好的生物相容性，故而被作為工程組織支架的首選。

I型膠原蛋白廣泛存在于自然界，在大部分的結(jié)締組織中，是主要的細(xì)胞外基質(zhì)成分，其具有典型的層級結(jié)構(gòu)。多肽鏈的一級結(jié)構(gòu)由重復(fù)的（Gly-X-Y）n組成，每三位由甘氨酸占據(jù)，X通常為脯氨酸，Y為羥基脯氨酸。3個α鏈交織形成3螺旋，進(jìn)一步形成纖維絲和纖維。整個結(jié)構(gòu)由分子間的氫鍵和共價鍵以及側(cè)鏈氨基酸殘基間的離子、疏水及靜電作用力穩(wěn)定。

基于膠原蛋白的材料已在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用多年，其優(yōu)勢包括良好的生物相容性、無毒性、無抗原性和可生物降解等。膠原蛋白支架可用作細(xì)胞粘附、增殖和分化的底物，也可通過體外重建形成微纖維結(jié)構(gòu)，模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)，所以其被認(rèn)為是理想的組織工程學(xué)材料。

膠原蛋白生物材料通常需要一定程度的交聯(lián)，以穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。化學(xué)交聯(lián)可將多肽鏈交聯(lián)形成網(wǎng)狀，常用的交聯(lián)劑包括戊二醛、EDC、N-羥基琥珀酰亞胺、異氰酸酯、單寧酸等。此外，光化學(xué)交聯(lián)也是常用的方法。酶也可用于交聯(lián)，如轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可選擇性介導(dǎo)相鄰蛋白纖維上谷氨酸鹽和賴氨酸的化學(xué)反應(yīng)，形成共價酰胺結(jié)合，增強(qiáng)3D基質(zhì)。生物聚合物也可通過非共價交聯(lián)鍵穩(wěn)定，如殼聚糖氨基基團(tuán)和膠原蛋白羧基基團(tuán)間形成的離子鍵。

膠原蛋白溶液合適的pH可促進(jìn)蛋白鏈之間離子反應(yīng)的發(fā)生，膠原蛋白在酸性pH條件下可溶，所以，在此條件下，膠原蛋白不能形成有序的層級結(jié)構(gòu)。所以對膠原蛋白進(jìn)行中和是制備凝膠的一種方法。在合適的條件下，中和過程伴隨著膠原蛋白分子聚集并排列形成細(xì)纖維。在此過程中，添加化學(xué)試劑可優(yōu)化最終材料的物理、化學(xué)和機(jī)械特性，但也可能影響其生物學(xué)特性和細(xì)胞粘附能力。本實驗使用透析法作為中和膠原蛋白溶液的方法，以減少制備過程中化學(xué)試劑的使用數(shù)量。

實驗

膠原蛋白從年輕白鼠尾部肌腱中分離。肌腱從粘附組織上刮離，用去離子水漂洗，置于8℃ 0.1M 醋酸中72h。離心去除雜質(zhì)和不溶性成分。然后將膠原蛋白溶液凍干。

制備1%膠原蛋白-醋酸溶液（起始pH=2.9），置于12-14kD Spectra/Por 再生纖維素透析袋內(nèi)。為確定最佳處理條件，分別使用3種透析液：水（pH=7）、0.1M NaOH （pH=13）以及10% NaCl（pH=7），體積為透析樣品12倍。透析于6℃進(jìn)行，連續(xù)攪拌，每12h更換透析液，以控制pH值。透析進(jìn)行7天后結(jié)束，此時透析液的pH值不再發(fā)生變化，說明膠原蛋白溶液的pH已與周圍透析液一致。

由于某些分析技術(shù)要求在無水條件下進(jìn)行，所以制備的材料采用空氣干燥或凍干。透析制備的膠原蛋白凝膠置于聚乙烯薄片上空氣干燥3天（干燥膠原蛋白），以進(jìn)行FTIR-ATR、熱分析和接觸角檢測。三類樣品凍干后（凍干膠原蛋白）檢測：直徑16mm/長10mm的膠原蛋白用于SEM成像檢測、直徑16mm/1mm厚的膠原蛋白用于體外測試、40mm長/2mm厚/5mm寬的膠原蛋白用于機(jī)械分析。

此外，為比較中性膠原蛋白和酸性膠原蛋白，制備了酸性膠原蛋白薄膜，即將1%膠原蛋白-醋酸溶液倒于聚乙烯薄片上，空氣干燥。

結(jié)果和討論

以不同溶液透析獲得的材料存在顯著差異：0.1M NaOH透析獲得的材料透明，但為半流體，不能維持其性狀；10% NaCl透析獲得的材料為白色、相對柔軟的凝膠；而以純水透析獲得的材料透明、性狀保持良好、耐受一定的壓力、具有彈性，且在37℃孵育24后，仍可保持穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。干燥后的中性膠原蛋白凝膠形成相對堅硬、多孔的海綿結(jié)構(gòu)。SEM成像分析可觀察到材料內(nèi)部孔壁表面的纖維樣突出，說明膠原蛋白鏈在透析過程中具有自組織能力，且紅外光譜分析也證實中性膠原蛋白結(jié)構(gòu)更有序，且含有大量的三螺旋結(jié)構(gòu)。對中性膠原蛋白的熱降解分析顯示，其具有較高的降解溫度，說明其更穩(wěn)定。對中性膠原蛋白的抗張強(qiáng)度測試也表明，其內(nèi)部膠原蛋白鏈存在多種交互，穩(wěn)定了蛋白組織結(jié)構(gòu)。凍干/干燥中性膠原蛋白具有較強(qiáng)的膨脹系數(shù)。此外，對膠原蛋白材料的體外生物學(xué)測試顯示，細(xì)胞可耐受中性膠原蛋白。

實驗結(jié)果證明，通過透析工藝，可制備穩(wěn)定、透明的膠原蛋白水凝膠，不溶于水和PBS緩沖液，且可顯著膨脹。改變膠原蛋白溶液的pH值，可獲得更有序的結(jié)構(gòu)，與天然膠原蛋白的三螺旋相近，且相比酸性膠原蛋白薄膜，材料的熱穩(wěn)定性更出色。凝膠凍干后，可獲得多孔、立體、形狀穩(wěn)定的材料，材料適于細(xì)胞生長，但由于材料表面無孔，細(xì)胞不會遷移進(jìn)入支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

透析中和法還可用于制備膠原蛋白和其它蛋白混合的水凝膠，如彈性蛋白以及糖胺聚糖。這些混合物為聚合電解質(zhì)，所以離子及靜電反應(yīng)可在分子間發(fā)生，從而改變膠原蛋白的結(jié)構(gòu)。不同大分子的添加可對水凝膠形成正面或負(fù)面的影響，但添加量不應(yīng)過多，以避免改變水凝膠的穩(wěn)定性，而且分子量應(yīng)足夠大，以防止在透析過程中通過膜孔而損失。

編者出于交流目的編譯、介紹此文，由于水平有限，如有不當(dāng)之處，敬請諒解，詳細(xì)內(nèi)容，請參考原文。

原文：Skopinska-Wisniewska J., Olszewski K., Bajek A., et al., Dialysis as a method of obtaining neutral collagen gels. Material Science and Engineering C, 2014, 40: 65-70.
 

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