通過四步輕松解決轉(zhuǎn)印帶來的麻煩

在之前的一篇文章中，我談到了彎曲條帶，這是一個常見由于凝膠鑄造和跑膠所引起的問題。 然而，雖然轉(zhuǎn)印似乎是一個更簡單的過程，但也很容易出錯。 下面我將介紹幾個有用的建議，讓您無時無刻地檢測到您的蛋白。

沒有條帶，意味著什么？

不幸的是，第一次你可能會認為你的轉(zhuǎn)印沒有起作用，當你在在暗室里成像時，沒有條帶（或者在實驗室的生物成像儀前面，但是做出結果的可能性不大）

第一步—簡單的轉(zhuǎn)印檢查

我們實驗者多使用預染Marker，簡單的轉(zhuǎn)印效率檢查是檢查您的凝膠中是否有任何殘留的染料。 你的Marker應該全部轉(zhuǎn)移，如果沒有，你的程序可能是錯誤的。 在這種情況下，嘗試更長時間轉(zhuǎn)印，冷凝裝置轉(zhuǎn)印和重新配置緩沖buffer。

如果你完全沒有看到，那么檢查你的轉(zhuǎn)印的極性。 查看“三明治結構”是否有錯誤 如果可以，考慮對三明治設備進行顏色編碼，并確保始終保持正確的極性。

第二步-詳細的轉(zhuǎn)印檢查

如果您想要更多信息，那么簡單的麗春紅染色是驗證您的轉(zhuǎn)移的一個很好的步驟。 在轉(zhuǎn)移后立即執(zhí)行，這是檢查您的泳道長度有效轉(zhuǎn)移的好方法。 染色PVDF和硝酸纖維素膜很好，麗春紅不適合染色尼龍膜。 再次，如果看到您的泳道長度轉(zhuǎn)印不佳，并嘗試更長時間，冷凝裝置轉(zhuǎn)印或重新配置轉(zhuǎn)印buffer。

麗春紅染色的膜顯示出有效的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移。 在大分子量和小分子量下的轉(zhuǎn)移效力有所降低。

現(xiàn)在有更好的免染膠技術，免染凝膠技術在不使用分析試劑盒和熒光染料的條件下可在蛋白凝膠和s轉(zhuǎn)印膜上檢測到蛋白條帶，免染凝膠含有三鹵代化合物與蛋白中的色氨酸殘基共價交聯(lián)產(chǎn)生熒光產(chǎn)物。電泳之后，蛋白分離，使用 UV進行交聯(lián)。UV 交聯(lián)之后，產(chǎn)生的熒光能夠被成像系統(tǒng)捕捉到，例如：Azure C 系列成像系統(tǒng)。免染技術不影響下游的檢測，結果可用于樣本的全蛋白定量（TPN），使用免染技術開展全蛋白定量，在抗體孵育之前印跡膜上的總蛋白可在成像系統(tǒng)中的 UV 模式下檢測到。每個泳道的總蛋白量通過計算泳道內(nèi)條帶的熒光強度來確定的�？贵w檢測完成之后，每個泳道的目的蛋白被歸一化到同一泳道的總蛋白中。

第三步-查看蛋白

如果您的蛋白分子量高（>120 kDa）或低（< 25 kDa）分子量，那么您應考慮更改轉(zhuǎn)印條件。 對于大分子量蛋白，考慮增加轉(zhuǎn)印時間，有時甚至可以過夜，但保持轉(zhuǎn)印在冷環(huán)境是很重要的。 對于較小分子量的蛋白質(zhì)，考慮減少轉(zhuǎn)印時間并降低電壓，以防止蛋白質(zhì)完全通過膜。

對于大分子量蛋白，可能值得考慮使用低濃度的凝膠來容易地將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到膜中。 相反，小蛋白質(zhì)容易離開凝膠透過膜，可以使用的孔徑0.2μm的膜。

最后，您的轉(zhuǎn)印緩沖液的組成可以對您的蛋白質(zhì)移印和結合容易程度產(chǎn)生巨大的影響。 對于大分子量蛋白，SDS可以促進從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上，而甲醇促進蛋白和膜結合，但抑制轉(zhuǎn)印。 因此可以考慮將甲醇稍微降至5-10％，并加入SDS至濃度為0.1％。 對于面臨其他問題的非常小的蛋白，SDS應從轉(zhuǎn)移緩沖液中消除，甲醇濃度提高到20％。

第四步-如果還沒有條帶？

在這一點上，熟練的人做轉(zhuǎn)印，但仍然沒有看到任何東西？ 如果您正在使用非常低豐度的蛋白或品質(zhì)不好的抗體，那么在這一點上，值得檢查的東西應該被肯定地表達出來。