IHC/ICC/IF實驗前需要知道的幾個要點~！

IHC/ICC/IF ,傻傻分不清楚？它們都是用于定位檢測抗原表達的免疫檢測技術，由于技術相對簡單且直觀，在科研和臨床上都得到了大量使用。但是影響最終檢測效果的變量非常多；每一個具體的檢測都會遇到多個需要調整的變量。具體到選擇何種方法來保存組織樣本；固定標本該用醇還是醛；如何選擇最合適的一抗；抗原修復具體該用什么樣的方法及條件等等一系列的問題都需要考慮。

 因此在開始實驗之前，最好先掌握以下幾組免疫檢測技術中的常識，能夠分清它們的特點將使你做出更好的實驗設計，提高實驗成功率。

石蠟切片VS冰凍切片

▶ 石蠟切片

石蠟包埋是最廉價且常用的組織包埋法，適用于需要長期保存的標本。在包埋之前須先將樣本固定，固定時間通常在4~24小時，需要考慮過度固定導致的抗原被遮蔽。在不能立即包埋的情況下，固定完成后的組織可以暫存在乙醇中。如果用樹脂替代石蠟做包埋劑，可以得到更薄的組織切片（1.5μm vs. 5μm）。石蠟切片步驟繁多，制片中抗原活性有所減低，但組織結構和細胞形態(tài)清晰，是免疫組織化學常規(guī)制備切片方法。

▶ 冰凍切片

冰凍切片無法長期保存，而且冷凍過程中冰晶形成容易影響亞細胞結構，使得組織結構不如石蠟切片清晰。冰凍組織切片可以在-80℃ 保存一年。冰凍切片步驟簡單快速，樣本不需要固定即可直接用液氮或者液態(tài)異戊烷、干冰等進行冰凍處理。冰凍和切片之后用乙醇固定切片可以避免表位被甲醛交聯，無需進行抗原修復。

在檢測諸如磷酸化或者一些對有機溶劑或熱的溫度耐受能力較差的細胞膜表面抗原和水解酶時，采用冰凍切片是很好的選擇。

 

甲醛固定VS醇固定

▶ 甲醛固定

甲醛是用于保存蛋白最常用的固定劑。甲醛能夠在多種蛋白質末端基團之間形成交聯，從而達到固定的效果。但是甲醛固定會改變抗原表位且阻止抗體結合。因此常常用酶消化或熱抗原修復法來使蛋白與甲醛交聯的醛鍵斷裂開，以便后續(xù)染色。在檢測磷酸依賴型的表位，選用冰冷的無水甲醇或無水乙醇來固定更為合適。

▶ 醇固定

常用的醇類固定劑有甲醇和乙醇，其固定的原理是與水競爭蛋白質中的氫鍵，從而替代組織中的水分子，在影響蛋白質三級結構的同時穩(wěn)定其二級結構。醇類會溶解脂類物質、并且對組織收縮較大，因此通常認為醇類固定不利于保護組織形。由于醇類固定會在組織表面很快形成一層蛋白膜，這層膜會影響固定液滲透，造成中間的組織固定不佳，因此醇類通常用于，固定冰凍組織切片和細胞，更適合于細胞膜表面抗原。醇固定之后不建議進行抗原修復，避免破壞樣本完整性。

 

組織固定VS細胞固定

▶ 組織固定

全動物灌流固定往往是保存抗原的最佳方法，適用于對小鼠、大鼠和豚鼠的完整組織的研究。剝離出來的組織可以用固定劑浸泡固定。常用的固定劑是是 PBS 配制的 4% 甲醛溶液。厚度在10 mm內的組織比較有利于固定劑滲透。為增強固定劑的穿透，。對于完全固定，固定劑的體積至少是組織體積的 50～100 倍。

▶ 細胞固定

細胞的固定比組織固定所需時間更短，可以使用濃度更低的固定劑。一般來說用 2% 的甲醛溶液在室溫下固定 20 分鐘就足以保存細胞形態(tài)和抗原性。大部分細胞只要去除培養(yǎng)基然后加入固定劑即可，對于一些去除培養(yǎng)基后會受到表面張力破壞的細胞，可以直接加入與培養(yǎng)基等體積的固定劑，對細胞進行預固定。兩分鐘后，去掉預固定培養(yǎng)基，加入新鮮的 2% 的固定劑繼續(xù)完成固定即可。

 

熱誘導修復VS酶誘導修復

▶ 熱誘導的表位修復（HIER）

在抗原修復過程中需要考慮抗原、抗體、組織類型、固定方法及持續(xù)時間等因素，因此需要針對各因素來優(yōu)化修復方案。常用的熱誘導表位修復可以用各類加熱設備開展，微波爐是最為方便的設備，選擇適合的熱修復緩沖液在適當的溫度和時間下能夠達到不錯的修復效果，這些條件都是需要根據經驗來確定的。在HIER法中，最重要的一點是修復完成后讓玻片自然冷卻，因為強制冷卻會使得蛋白質難以恢復原有構型。

▶ 蛋白酶誘導的表位修復（PIER）

蛋白酶誘導的表位修復作用機制是酶切割可能掩蓋表位的肽段，常用蛋白酶 K、胰蛋白酶和胃蛋白酶等進行修復，PIER 方法由于可能破壞組織形態(tài)和目的抗原，且成功率較低，通常較少使用。

與比單克隆抗體相比，多克隆抗體能識別多個表位，即使不進行抗原修復，檢測到抗原的可能性也很高。

 

單克隆一抗VS多克隆一抗

單克隆抗體由于其來源于單個B細胞，具有高親和力和以及針對單個抗原表位的高特異性。單抗在抗原能夠保持天然構象的時候結合效果最好，一旦抗原構象發(fā)生改變，其結合效果就會大打折扣。因此單抗與抗原的結合容易受到溫度、pH、固定、鹽濃度以及翻譯后修飾、蛋白質相互作用等因素的干擾。

多克隆抗體可識別多個表位，因此它們較少受到蛋白構象變化的影響。通常多克隆抗體對pH變化和鹽濃度影響下的穩(wěn)定性也比單克隆抗體更好。因此在IHC/ICC實驗中更多的選擇多克隆抗體。

 

直接檢測VS間接檢測

高表達的抗原一般可以通過直接檢測來實現。直接檢測不受二抗非特異性結合的干擾，在進行多色檢測的時候操作更加簡單。但是檢測的靈敏度有限，對于低表達的抗原無能為力，因此該方法的運用受到抗原豐度的限制。

間接檢測方法通過每一個一抗與至少兩個二抗結合來放大檢測信號，因此檢測限更低，能夠產生更強的信號。但是由于需要結合二抗而增加了封閉和對照。

最常見的生物素—親和素系統(tǒng)（Biotin-Avidin—System，BAS）幾乎可與目前研究成功的各種標記物結合。生物素與親和素之間高親合力的牢固結合以及多級放大效應，使BAS免疫標記和有關示蹤分析更加靈敏。目前廣泛用于微量抗原、抗體定性、定量檢測及定位觀察研究。鏈霉親和素與親和素一樣，每一分子能結合4分子生物素，同時鏈霉親和素不帶任何糖基，避免了項親和素一樣與細胞表面的多糖發(fā)生非特異結合。因此采用生物素化二抗與親和素或鏈霉親和素孵育可以明顯放大信號。

 

熒光檢測VS顯色檢測

 

▶ 熒光檢測

熒光檢測是基于熒光色素的使用，它們在受到較短波長的光激發(fā)時發(fā)光。熒光色素可直接與一抗或二抗結合，或與鏈霉親和素結合。免疫熒光常用于多個細胞目標的同時觀察。例如，組織可與不同的一抗混合物孵育，再與結合有熒光色素的二抗孵育，這些熒光染料在不同波長下發(fā)光。

多色實驗必須經過設計，以限制檢測試劑之間的交叉反應性，以及所使用的熒光染料在光譜性質上的交叉。為了限制二抗之間的交叉反應性，一抗應來自不同的物種。這樣就能使用物種特異的二抗，分別只識別一個一抗。

_{來源R&DSystems}

相關鏈接：

• 免疫組化（IHC）
• 免疫熒光（IF）
• 激光共聚焦（Confocal）
• 細胞實驗（流式、增殖、侵襲、電鏡）