膠體金標(biāo)記技術(shù)及其應(yīng)用解析

   膠體金是氯金酸在還原劑的作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用形成一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱之為膠體金。膠體金溶液的常見制備方法大致分為白磷還原法、硼氫化鈉還原法、抗壞血酸鹽還原法、檸檬酸三鈉還原法和鞣酸檸檬酸三鈉還原法。其基本原理是向一定濃度的金溶液內(nèi)加入適量還原劑，使金離子還原為金原子。通過改變反應(yīng)體系中氯金酸與還原劑的比例可得到所需不同直徑的金顆粒。

一. 膠體金標(biāo)記

   在堿性條件下，膠體金顆粒表面帶負(fù)電荷，可與目標(biāo)蛋白質(zhì)所帶正電荷基團(tuán)之間形成非共價鍵的靜電吸引而牢固結(jié)合，這種結(jié)合對所標(biāo)蛋白的生物學(xué)活性無明顯影響。吸附在膠體金表面的抗原或抗體能定向?qū)⒛z體金顆粒載運(yùn)到組織或細(xì)胞內(nèi)、固相載體上相應(yīng)抗體或抗原的位置。由于金顆粒具高電子密度的特性，這些標(biāo)記物在抗原抗體反應(yīng)處聚集達(dá)到一定密度時（即金顆粒107個/mm2），出現(xiàn)肉眼可見的粉紅色斑點(diǎn)。                         
    進(jìn)行膠體金標(biāo)記需要對pH環(huán)境、蛋白/抗體濃度、參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，采用的方法為濃度梯度法。
 

A 最適pH選擇
    pH是標(biāo)記過程的關(guān)鍵決定因素，一般在蛋白/抗體等電點(diǎn)pI略偏堿性的環(huán)境下標(biāo)記效果最好，可以采用加入0.1 M碳酸鉀或者0.1 N鹽酸的方法調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH。同時，因為膠體金溶液可能損傷探頭，所以常采用精密pH試紙進(jìn)行pH測定。操作時將膠體金溶液調(diào)節(jié)到3~10八個pH梯度，加入被標(biāo)記的蛋白/抗體，混合后室溫放置15 min，再加入10%氯化鈉室溫放置15 min，記錄保持紅色的最低pH，記為pH0；然后設(shè)置pH梯度為pH0-0.6、pH0-0.3、pH0、pH0+0.3、pH0+0.6、pH0+1，重復(fù)前面的操作，直到找到室溫放置2 h仍保持紅色的最低pH。

    一般我們標(biāo)記抗體IgG最適pH在9.0，單克隆抗體在8.2，SPA（proteinA）在5.9-6.2，其他常用的蛋白標(biāo)記pH見下表：

B 蛋白濃度優(yōu)化 
    優(yōu)化了pH值后，繼續(xù)優(yōu)化標(biāo)記的最低蛋白/抗體濃度，也是采用梯度法，用不同濃度蛋白/抗體溶液與膠體金（已處于最佳pH環(huán)境）溶液混合后室溫放置15 min，加入10%氯化鈉室溫放置2 h，測定OD520~580，以吸光值對蛋白/抗體濃度作圖，取線性趨勢線與橫軸交點(diǎn)的蛋白/抗體濃度為最小蛋白/抗體濃度。
    確定了最適pH及最小蛋白/抗體濃度后，可以開始進(jìn)行金標(biāo)記了。在調(diào)節(jié)好pH的膠體金溶液中邊迅速攪拌邊逐滴加入蛋白/抗體（濃度是之前確定的最小值的1.2倍），5min內(nèi)加完，再加入10% BSA至BSA終濃度為1%，攪拌10 min。低溫超速離心去除未標(biāo)記蛋白/抗體及未充分標(biāo)記的膠體金，具體方法可參考：先1500 rpm低速離心1 h去掉沉淀，然后15000 rpm離心1 h去掉上清，沉淀用含1% BSA的TBS溶解，重復(fù)高速離心三遍，得到可用于試紙條制備的金標(biāo)蛋白/抗體溶液。

C參數(shù)優(yōu)化（部分條件優(yōu)化舉例）
1 樣品墊與金標(biāo)墊的組合優(yōu)化
樣品墊處理液的pH設(shè)置三個梯度（7.2、8.0、9.0），金標(biāo)蛋白/抗體溶液設(shè)置三個稀釋倍數(shù)（1:1、1:2、1:3）制成金標(biāo)墊，交叉組合觀察加入陽性、陰性對照（生理鹽水）后的顯色情況（T線和C線均以1 mg/mL的濃度包被）。
   
   這里主要是對樣品墊處理液pH及金標(biāo)物質(zhì)的濃度進(jìn)行優(yōu)化，另外我們也可以對樣品墊和金標(biāo)墊的處理液成分進(jìn)行優(yōu)化，這需要設(shè)計各種組合進(jìn)行測試。
 
                                                          2 T線、C線包被濃度優(yōu)化
     

   將要包被的抗體進(jìn)行1:1、1:2、1:3的稀釋，包被NC膜后經(jīng)陽性、陰性對照（生理鹽水）檢測觀察顯色情況，選擇最佳稀釋倍數(shù)（濃度）。
   將要包被的抗原進(jìn)行1:10、1:20、1:40、1:50、1:100的稀釋，抗體濃度采用上一步優(yōu)化的濃度，包被NC膜，經(jīng)陽性、陰性對照（生理鹽水）檢測觀察顯色情況，選擇最佳稀釋倍數(shù)（濃度）。
   當(dāng)然，我們也可以采用組合試驗進(jìn)行二者包被濃度的優(yōu)化。

3 檢測墊封閉時間優(yōu)化  
   檢測墊封閉時間設(shè)定1 h、0.5 h、1 h、2 h四個梯度，用之前優(yōu)化的參數(shù)組裝試紙條，加入陽性、陰性對照（生理鹽水）檢測觀察顯色情況，選擇最佳封閉時間。同時，我們也可以對BSA的濃度進(jìn)行優(yōu)化，以及對包被物質(zhì)的選擇進(jìn)行優(yōu)化，或者進(jìn)行多個參數(shù)的組合優(yōu)化。

二．免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用
   早期免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)主要應(yīng)用于光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞表面抗原進(jìn)行組化研究，但因靈敏度低而受到限制，IGSS創(chuàng)立以后免疫金標(biāo)記技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用。目前，免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)在組化中的應(yīng)用已日趨普遍，膠體金探針的種類也越來越多。由于膠體金的高電子密度使其在電鏡下清晰可辨，因此該技術(shù)進(jìn)一步在電鏡上使用，由對組織細(xì)胞定位研究，進(jìn)一步深入到了基因轉(zhuǎn)錄水平、基因表達(dá)的檢測、染色體的基因定位、特定核酸序列在細(xì)胞內(nèi)的空間分布分析及核酸復(fù)制過程中的定性與定量分析等。