Sema3a-CreERT2小鼠用于特異靶向心臟Purkinje纖維
上個月，中國科學(xué)院生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所周斌研究組又有新科研成果發(fā)表在 Scientific Reports 上啦，題為“Genetic targeting of Purkinje fibres by Sema3a-CreERT2 ”，提供了一種新的遺傳學(xué)工具——Sema3a-CreERT2工具鼠——用于研究調(diào)節(jié)浦肯野纖維功能的分子機制。
本研究中Sema3a-CreERT2 工具鼠由上海南方模式生物構(gòu)建。
研究背景：
心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)（cardiac conduction system ）是由位于心壁內(nèi)，由特有的功能高度分化的心肌細胞構(gòu)成，其功能是產(chǎn)生電沖動并傳導(dǎo)到心臟各部，使心房肌和心室肌按一定節(jié)律性收縮。心臟收縮從右心房竇房結(jié)（SA結(jié)）開始。然后，電活動在房室結(jié)（AV結(jié)）處延遲，隨后通過房室束（His束及束支）快速傳導(dǎo)并迅速地傳播到整個心室壁。心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)功能異常就可能導(dǎo)致心律失常。
（圖片來源：https://en.wikipedia.org/wiki/file:ECG_Principle_fast.gif）
本文的主角，浦肯野纖維（Purkinje fiber），是構(gòu)成房室束及其分支的主要細胞，又稱束細胞。浦肯野纖維細胞間連接及其離子通道機制是保證心臟電沖動正常傳導(dǎo)的基礎(chǔ)，當(dāng)細胞間連接及跨膜離子流發(fā)生變化時，浦肯野纖維系統(tǒng)電生理發(fā)生改變，從而導(dǎo)致心律失常。因此，了解調(diào)節(jié)浦肯野纖維發(fā)育、形成、以及維持正常功能的分子機制就將為心律失常的病理生理過程提供解釋與證據(jù)。
圖2. Isolated heart conduction system showing Purkinje fibers
先前的研究中，有一些Cre或CreERT2工具鼠被用來標(biāo)記心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)。比如：
- 用Hcn4-CreERT2來標(biāo)記傳導(dǎo)系統(tǒng)，包括竇房結(jié)、部分房室結(jié)、His束、束支和浦肯野纖維。不過，除傳導(dǎo)系統(tǒng)以外，Hcn4-CreERT2還會把發(fā)育中的心臟的部分內(nèi)皮細胞也標(biāo)記上。
- Cntn2-Cre也是心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)的另一種遺傳工具，它特異性靶向SA結(jié)、AV結(jié)，左束支和右束支以及浦肯野纖維。
- Cx40-CreERT2靶向心房和VCS心肌細胞，以及冠狀動脈內(nèi)皮細胞。
可惜的是，缺乏特異性靶向浦肯野纖維（而不靶向其它細胞）的專一性工具，對于專門研究浦肯野纖維的功能還是不夠的。
小鼠模型：
Sema3a-CreERT2小鼠：
由于已知Sema3a基因敲除純合子小鼠具有感覺和交感神經(jīng)元異常、胚胎骨和軟骨結(jié)構(gòu)異常、心臟缺陷和出生后死亡的嚴(yán)重不良表型，故利用經(jīng)典 ES 細胞打靶技術(shù)，將誘導(dǎo)型 CreERT2 插入到小鼠 Sema3a 基因的起始密碼子位置，構(gòu)建Sema3a-CreERT2小鼠模型。該品系由上海南方模式生物構(gòu)建。
圖3. Sema3a-CreERT2構(gòu)建策略于基因型鑒定結(jié)果。
R26-tdTomato 小鼠：在小鼠Rosa26位點定點插入條件性表達的tdTomato報告基因。
研究結(jié)果：
構(gòu)建Sema3a-CreERT2小鼠模型。
Sema3a是從無脊椎動物到脊椎動物都保守的信號素家族的成員。研究表明Sema3a在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中具有重要作用。 Sema3a可能是一種化學(xué)抑制劑，可以抑制軸突的生長，尤其是外周神經(jīng)軸突，從而維持正常的神經(jīng)元形態(tài)模式。 Sema3a的過度表達會導(dǎo)致神經(jīng)疾病，如精神分裂癥；而Sema3a缺陷又導(dǎo)致異常的神經(jīng)元系統(tǒng)。此外，Sema3a還在免疫調(diào)節(jié)和癌癥發(fā)展中起到生理作用。最近的一項研究表明Sema3a可以通過調(diào)節(jié)交感神經(jīng)支配的模式來保持正常的心律。雖然有研究發(fā)現(xiàn)Sema3a在Purkinje纖維和小梁心肌細胞亞組中表達，但Sema3a在心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)中的譜系追蹤卻至今沒有報道。
利用經(jīng)典 ES 細胞打靶技術(shù)，將誘導(dǎo)型 CreERT2 插入到小鼠 Sema3a 基因的起始密碼子位置，構(gòu)建Sema3a-CreERT2小鼠模型。用雌激素受體（ESR）抗體染色作為Sema3a的替代物，檢測Sema3a在Sema3a-CreERT2小鼠組織中的表達。 在E12.5，E14.5和E19.5胚胎心臟切片中對 ESR（代替Sema3a）和TNNI3（心肌細胞Marker） 共染色。免疫染色結(jié)果顯示ESR/Sema3a主要在小梁心肌表達，但在E12.5和E14.5天的胚胎心臟致密層中也檢測到少量的表達。在E19.5天，ESR/Sema3a在位于心室腔側(cè)的心內(nèi)膜下小梁心肌細胞中表達。在致密心肌的心肌細胞或冠狀動脈中未檢測到ESR/Sema3a�？傊�，這些數(shù)據(jù)與早前對Sema3a表達的研究一致，證明了Sema3a-CreERT2小鼠構(gòu)建成功。
圖4. （a-b）Sema3a-CreERT2構(gòu)建策略于基因型鑒定結(jié)果。（c）在E12.5，E14.5和E19.5天 Sema3a-CreERT2小鼠心臟雌激素受體（ESR）免疫熒光染色，指示Sema3a的表達。 箭頭指示Sema3a+心肌細胞。
Sema3a-CreERT2在成年小鼠心臟中標(biāo)記浦肯野纖維。
根據(jù)Sema3a-CreERT2小鼠的ESR染色分析，Sema3a主要在小梁心肌細胞中表達，而不是在致密層中。由于浦肯野纖維主要集中在心室壁的最內(nèi)層，接下來就需要確定Sema3a-CreERT2是否可以特異性靶向成年小鼠心臟中的浦肯野纖維。通過Sema3a-CreERT2與R26-tdTomato小鼠交配獲得Sema3a-CreERT2; R26-tdTomato雙陽性小鼠。 只有在他莫昔芬存在時，CreERT2才會從細胞質(zhì)易位到細胞核中進行Cre-loxP重組，這就可以使Sema3a +細胞及其后代中永久標(biāo)記上tdTomato紅色熒光（RFP）（圖5b）。
對8-12周齡的小鼠給予他莫昔芬誘導(dǎo)，并在他莫昔芬處理48小時后收集心臟組織樣本，發(fā)現(xiàn)在心房心肌細胞有稀疏的RFP+細胞（圖5c-d）。為了確定Sema3a是否在SA結(jié)和AV結(jié)中表達，對HCN4和RFP進行共染色，發(fā)現(xiàn)Sema3a在SA結(jié)中不表達并且在AV節(jié)點中有少量表達（圖5e-f）。Cx40在研究中被用來作為心室傳導(dǎo)系統(tǒng)（VCS）marker，因此我們生成了Sema3a CreERT2; R26-tdTomato; Cx40 GFP三陽性小鼠來檢測浦肯野纖維中Sema3a的表達。發(fā)現(xiàn)RFP與GFP+細胞共同定位于心室壁的心內(nèi)膜下層，而致密心肌中的GFP+冠狀動脈則未檢測到RFP信號（圖5g）。心臟整體熒光結(jié)果顯示Cx40在心房中表現(xiàn)出總體表達，而幾乎未檢測到Sema3a。 Cx40也在His（HB）束中，在左束支和右束支以及浦肯野纖維中表達，這與之前的報道一致。與Cx40（GFP信號）相比，Sema3a（RFP信號）很大程度上只存在浦肯野纖維中，并且在His束或束支中也沒有檢測到（圖5h-i）。 Z-stack共聚焦證實Sema3a（RFP信號）在心室心肌心內(nèi)膜下的Cx40陽性浦肯野纖維中表達（圖5j）。這些數(shù)據(jù)表明，Sema3a-CreERT2能夠特異性靶向成年小鼠心臟中的心室浦肯野纖維。
圖5. 成年小鼠心臟中Sema3a表達譜。 （a）Sema3a-CreERT2; R26-tdTomato小鼠交配示意圖。 （b）通過他莫昔芬誘導(dǎo)標(biāo)記Sema3a+細胞示意圖。 （c）Sema3a-CreERT2; R26-tdTomato小鼠心臟整體紅色熒光RFP表達示意圖。 （d）Sema3a-CreERT2; R26-tdTomato小鼠RFP和TNNI3免疫熒光染色顯示心房中RFP+細胞稀少。 （e）在SA結(jié)中未檢測到Sema3a+細胞。 （f）Sema3a在AV結(jié)中的表達。 （g）Sema3a-CreERT2; R26-tdTomato小鼠中RFP，GFP和TNNI3的免疫染色顯示CX40+冠狀動脈（箭頭所示）呈RFP陰性。 （h）Sema3a-CreERT2; R26-tdTomato; Cx40-GFP小鼠心臟的整體熒光視圖。虛線表示IVS和LVW之間的界限。 （i）對Sema3a-CreERT2; R26-tdTomato; Cx40-GFP小鼠心臟LBB或RBB中未檢測到Sema3a，而Cx40-GFP為陽性。 （j） Z-stack共聚焦顯示Sema3a在浦肯野纖維中表達。
利用Sema3a-CreERT2對浦肯野纖維進行譜系追蹤。
由于Sema3a在胚胎時期比在成年后具有更廣泛地表達，那么問題來了，Sema3a+心肌細胞是什么時候開始向浦肯野纖維的命運發(fā)展的呢？
將他莫昔芬注射到E12.5，E14.5或E18.5天的Sema3a-CreERT2; R26-tdTomato; Cx40-GFP三陽性小鼠中，并在P7或P21天對小鼠心臟進行分析。譜系示蹤數(shù)據(jù)顯示E12.5開始誘導(dǎo)標(biāo)記的Sema3a+細胞在P7和P21時產(chǎn)生了Cx40陽性的浦肯野纖維（少數(shù)）和Cx40陰性的工作心肌細胞（大部分）（圖6a-b）。 E14.5的Sema3a+細胞更局限于心室心肌的心內(nèi)膜層，并在P7和P21時產(chǎn)生Cx40陽性的浦肯野纖維和Cx40陰性的工作心肌細胞（圖6c-d）。E18.5開始誘導(dǎo)標(biāo)記的Sema3a+細胞在P7和P21天的心室心內(nèi)膜下表面產(chǎn)生了幾乎所有的Cx40陽性的浦肯野纖維，而Cx40陰性的工作心肌細胞則很少（圖6e-f）。這些數(shù)據(jù)表明，Sema3a+心肌細胞在圍產(chǎn)期階段（例如E18.5天）開始了其心室傳導(dǎo)系統(tǒng)特化的命運（圖6g）。
圖6. Sema3a+心肌細胞在心臟發(fā)育過程中的傳導(dǎo)系統(tǒng)特化。
（a-f）在E12.5（a，b），E14.5（c，d）和E18.5（e，f）對Sema3a-CreERT2;R26-tdTomato; Cx40-GFP三陽性小鼠給予他莫昔芬誘導(dǎo)。 每組在P7和P21收集心臟。Z-stack共聚焦顯示Sema3a與Cx40熒光表達情況。（g）示意圖分別表示發(fā)育中和成年心臟中的Sema3a +細胞（紅色）和Cx40 +細胞（綠色）。
Sema3a+心肌細胞的定量。
Sema3a+心肌細胞在心臟中到底占多大比例呢？通過將他莫昔芬注射到成年小鼠中體內(nèi)誘導(dǎo)Sema3a+標(biāo)記，在他莫昔芬處理48小時后對心臟進行分析。 RFP和TNNI3免疫熒光染色顯示在心室心肌的心內(nèi)膜下表面的RFP+心肌細胞（圖7a）。對心臟切片中RFP+心肌細胞比例進行定量分析，結(jié)果1.02±0.13％心肌細胞被Sema3a-CreERT2標(biāo)記上紅色熒光，而在他莫昔芬未處理的情況下幾乎沒有心肌細胞被標(biāo)記上（圖7c）。將心肌細胞分離出來進行定量（圖7b，d）也得到了一致的結(jié)果。
圖7. 成年心臟中Sema3a+心肌細胞數(shù)量的定量分析。
（a）成年心臟中RFP和TNNI3的免疫熒光染色。 IVS，室間隔; RVW，右心室壁。（b）來自成年Sema3a CreERT2; R26-tdtomato小鼠的分離后心肌細胞。 （c）定量心臟RFP+心肌細胞的百分比。 （d）定量分離后的RFP+心肌細胞百分比。
Sema3a-CreERT2 作為一種全新的遺傳工具小鼠，它特異性靶向成年小鼠心臟中的浦肯野纖維。它較Hcn4-CreERT2（靶向竇房結(jié)、房室結(jié)、His束、束支和浦肯野纖維）和Cntn2-Cre（靶向SA結(jié)，AV結(jié)和His-Purkinje系統(tǒng)）對浦肯野纖維更具有針對性。與Cx40-CreERT2工具相比，Sema3a-CreERT2也不會標(biāo)記冠狀動脈內(nèi)皮細胞或心房心肌細胞。
對浦肯野纖維的譜系示蹤結(jié)果表明，Sema3a+細胞在早期胚胎階段主要向小梁心肌細胞發(fā)育，而在圍產(chǎn)期期間，Sema3a+心肌細胞呈現(xiàn)特化為浦肯野纖維的命運。
