Circulation Research |器官特異性血管遺傳靶向技術(shù)及應(yīng)用

5月15日，中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所周斌研究組在國際學(xué)術(shù)期刊Circulation Research上發(fā)表了題為“Genetic Targeting of Organ-Specific Blood Vessels”的最新研究成果。該項(xiàng)工作建立一套新的遺傳操作系統(tǒng)以實(shí)現(xiàn)更加精確的遺傳靶向，可用于基因敲除和過表達(dá)。

南模生物為該研究構(gòu)建了順序交叉遺傳靶向工具小鼠模型。

到目前為止，遺傳靶向工具主要依賴于Cre-LoxP同源重組系統(tǒng)以解決細(xì)胞示蹤問題，進(jìn)行基因功能研究。該系統(tǒng)的精度在很大程度上取決于驅(qū)動(dòng)Cre的啟動(dòng)子或基因表達(dá)的特異性。也就是指，如果將Cre表達(dá)元件插入到A基因中，那么在表達(dá)A基因的細(xì)胞中可以發(fā)揮Cre重組作用。而A基因往往并不能特異性地只在某種特定器官或組織中表達(dá)，所以這種傳統(tǒng)方法具有固有的局限性。

例如：研究血管常用的遺傳工具鼠有VE-cad-Cre、Tie2-Cre等，然而這些工具鼠標(biāo)記的是所有的內(nèi)皮細(xì)胞，而無法精確地研究特定組織器官的血管。不同器官的血管在結(jié)構(gòu)及功能上是異質(zhì)性的。不同器官的內(nèi)皮細(xì)胞在損傷反應(yīng)中的作用都是獨(dú)特的。因此，如何提高遺傳靶向的精度，開發(fā)組織特異性Cre工具鼠，對(duì)于研究特定細(xì)胞類型在某一種器官形成及再生過程中的深入功能研究具有重要意義。

在這項(xiàng)最新的研究中，研究人員精妙地利用Cre-loxP和Dre-rox兩套系統(tǒng)，互相排他的重組系統(tǒng)進(jìn)行順序交叉遺傳靶向操縱，實(shí)現(xiàn)精確地遺傳靶向器官特異性的血管。

核 心：順序交叉遺傳靶向操縱系統(tǒng)

兩個(gè)要素：

兩種不同的啟動(dòng)子分別來驅(qū)動(dòng)Dre和Cre —— A-Dre 和 B-CrexER（下圖B）。

• A-Dre：通過 knockin 方式，將 Dre 插入到 A基因座中，使 Dre 的表達(dá)與 A基因的表達(dá)譜一致。

• B-CrexER：通過 knockin 方式，將 CrexER 元件插入到 B基因座中。CrexER是一種新型的誘導(dǎo)型工具鼠——將兩個(gè)rox位點(diǎn)分別放置于雌激素受體（ER）的兩側(cè)，即Cre-rox-ER-rox。

按照這個(gè)順序交叉靶向系統(tǒng)的設(shè)計(jì)（下圖C），一般情況下，Cre-ER融合蛋白停留在細(xì)胞質(zhì)中，無法入核進(jìn)行Cre-LoxP反應(yīng)。只有在同時(shí)表達(dá)A基因和B基因的細(xì)胞中，Dre重組酶將識(shí)別并切割Rox位點(diǎn)，之后B-Cre從細(xì)胞質(zhì)中釋放入核，進(jìn)行后續(xù)的Cre-LoxP重組反應(yīng)。

利用神經(jīng)嵴表達(dá)的 Nrg1-CrexER 與廣泛表達(dá)的 CAG-Dre 驗(yàn)證了  CrexER 在經(jīng) Dre 切除了 ER-rox 后，Cre-rox融合蛋白仍具有重組酶活性，且特異而有效地在體內(nèi)發(fā)揮Cre重組酶作用。并且 CrexER本身沒有漏表達(dá)情況的發(fā)生。這些數(shù)據(jù)驗(yàn)證了Dre介導(dǎo)的Cre表達(dá)的策略的可行性，并證實(shí)了這種新型CrexER可用于進(jìn)行體內(nèi)順序交叉遺傳靶向。

圖1. Proof-of-principle for a sequential recombination strategy for genetic targeting.

順序交叉遺傳靶向操縱系統(tǒng)是利用兩個(gè)啟動(dòng)子更加精確地限定了標(biāo)記的細(xì)胞，并且最后的有效輸出是Cre重組酶。而兩個(gè)標(biāo)記基因A和B的選擇對(duì)于整個(gè)系統(tǒng)是否成功至關(guān)重要，需要前期文獻(xiàn)與實(shí)驗(yàn)中對(duì)表達(dá)譜有全面的了解。

這項(xiàng)研究中，研究人員就分別在心臟和大腦中各找到了2個(gè)Marker基因，成功地實(shí)現(xiàn)了在心臟和大腦中特異性標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞。

應(yīng)用1：心臟冠狀內(nèi)皮細(xì)胞特異性CoEC-Cre

• Tie2-Dre：Tie2是泛內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，在大多數(shù)血管以及某些骨髓細(xì)胞群中均有表達(dá)。通過將Dre敲入到內(nèi)源Tie2基因的ATG位置，建立Tie2-Dre工具鼠。

• Wt1-CrexER：有報(bào)道稱間皮細(xì)胞標(biāo)志物Wt1在發(fā)育中的冠狀動(dòng)脈血管中表達(dá)，但不在其他血管中表達(dá)。除了心外膜細(xì)胞外，Wt1-CreER在胚胎心臟中標(biāo)記冠狀內(nèi)皮細(xì)胞。通過將CrexER插入到Wt1基因的翻譯起始密碼子（ATG）位置，建立Wt1-CrexER工具鼠。（圖2A-B）

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Tie2-Dre;Wt1-CrexER確實(shí)可以特異且有效地標(biāo)記冠狀血管（圖2C-E）。作為內(nèi)部對(duì)照，沒有檢測(cè)到Tie2-Dre;R26-tdTomato組織中的任何tdTomato+細(xì)胞，從而排除了Dre-loxP重組。Wt1-CrexER; T26-tdTomato小鼠中在未給他莫昔芬處理的情況下，也沒有檢測(cè)到任何tdTomato+細(xì)胞，說明Wt1-CrexER沒有漏表達(dá)。

這些數(shù)據(jù)表明Cre-loxP重組僅在Tie2-Dre和Wt1-CrexER雙重組系統(tǒng)中才發(fā)生，Tie2-Dre;Wt1-CrexER（以下簡稱 CoEC-Cre ）可排它性地特異靶向心臟血管。接下來驗(yàn)證雙重組系統(tǒng)在基因敲除或過表達(dá)中的應(yīng)用。

圖2. Genetic targeting of coronary vessels by Tie2-Dre;Wt1-CrexER line.

冠狀血管內(nèi)皮細(xì)胞中特異性基因操縱

心臟特異性血管中的基因敲除

VEGFR2（Kdr）在大多數(shù)器官的內(nèi)皮細(xì)胞中普遍表達(dá)，過去要在冠狀動(dòng)脈中特異性靶向該基因幾乎是不可能做到的，因此選擇Kdr基因作為靶基因來驗(yàn)證CoER-Cre系統(tǒng)在條件性基因敲除中的應(yīng)用。

通過Kdr flox小鼠與CoEC-Cre（Tie2-Dre;Wt1-CrexER）交配（圖3A）。為了同時(shí)能夠示蹤，再引入R26-tdTomato報(bào)告基因小鼠。

• 敲除組為：Tie2-DRE;WT1-CrexER; Kdrflox/flox;R26-tdTomato小鼠；

• 同窩對(duì)照組為：Tie2-DRE;WT1-CrexER; Kdrflox/+;R26-tdTomato小鼠。

E14.5心臟切片免疫染色檢測(cè)tdTomato、VEGFR2和CDH5，結(jié)果顯示VEGFR2在tdTomato+ CDH5+冠狀內(nèi)皮細(xì)胞敲除組小鼠心臟的致密心肌內(nèi)的缺失（圖3B-D）。而在心肌小梁的心內(nèi)膜細(xì)胞中，VEGFR2表達(dá)不受影響，表明CoEC-Cre重組特異性靶向表達(dá)Wt1的冠狀內(nèi)皮細(xì)胞，而不是心內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞（胚胎期不表達(dá)Wt1）。

心臟特異性血管中的基因過表達(dá)

選擇人類白喉毒素受體（DTR）作為過表達(dá)基因。將CoEC-Cre與R26-iDTR小鼠雜交，其中DTR表達(dá)受Cre-loxP重組作用的控制（圖3E）�？梢酝ㄟ^白喉毒素（DT）處理來特異性消除表達(dá)DTR的冠狀內(nèi)皮細(xì)胞，從而驗(yàn)證這套系統(tǒng)在基因過表達(dá)中也是可行的。免疫染色顯示僅在冠狀內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)DTR（圖3F）；內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的嚴(yán)重破壞，說明細(xì)胞凋亡（圖3G）。Tie2-Dre; Wt1-CrexER; R26-iDTR小鼠DT給藥組和未給藥對(duì)照組的心臟切片TUNEL+細(xì)胞數(shù)目有顯著差異（圖3H，I）。

綜合上述基因敲除和過表達(dá)兩個(gè)實(shí)驗(yàn)，表明新的基因靶向系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)排它性地在冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中允進(jìn)行基因操作，而不影響其他器官系統(tǒng)。

圖3. Gene knockout and over-expression in coronary endothelial cells.

應(yīng)用2：大腦內(nèi)皮細(xì)胞特異性BEC-Cre

• Tie2-Dre：同上文

• Mfsd2a-CrexER：先前的研究表明Mfsd2a在腦內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，但也在其他細(xì)胞類型中表達(dá)（圖4A）。將編碼CrexER的cDNA插入到Mfsd2a基因的第一個(gè)外顯子的ATG位置，建立Mfsd2a-CrexER工具小鼠，并驗(yàn)證了該小鼠中CreER的表達(dá)。然后將Tie2-Dre工具鼠與之交配，獲得Tie2-Dre;Mfsd2a-CrexER雙陽性小鼠（以下稱為BEC-Cre）（圖4B）。

與常規(guī)靶向腦血管和神經(jīng)元的Mfsd2a-CreER相比，BEC-Cre能夠有效且特異地靶向腦血管，特異性優(yōu)于Mfsd2a-CreER，而不標(biāo)記任何神經(jīng)元（圖4C-E）。更重要的是，除了特異性，BEC-Cre相比傳統(tǒng)的Mfsd2a-CreER，能夠在腦內(nèi)皮細(xì)胞中更有效地發(fā)揮Cre重組作用（圖4E）。另外，BEC-Cre沒有靶向任何門靜脈肝細(xì)胞，也沒有靶向其他器官或組織中的血管。tdTomato+內(nèi)皮細(xì)胞在腦和其他器官或組織中的百分比定量統(tǒng)計(jì)也證實(shí)了BEC-Cre小鼠的效率和特異性（圖4G）。

圖4. Specific and efficient brain endothelial cell targeting。

腦特異性血管內(nèi)皮細(xì)胞中的基因操縱

腦特異性血管中的基因敲除

同樣地，再次使用VEGFR2（Kdr）作為靶基因，獲得基因敲除組（Tie2-Dre; Mfsd2a-CrexER; Kdrflox/flox; R26-tdTomato）和同窩對(duì)照組（Tie2-Dre; Mfsd2a-CrexER; Kdrflox/+; R26-tdTomato）小鼠（圖5A）。在新生小鼠大腦中，基因敲除組幾乎檢測(cè)不到VEGFR2+血管（圖5B-C）；而其他器官或組織中的血管中沒有檢測(cè)VEGFR2表達(dá)的降低，證明Kdr在腦血管中的特異性缺失。與對(duì)照組相比，基因敲除組中的血管密度顯著降低（圖5D）；還觀察到無血管區(qū)域的擴(kuò)大，大腦缺氧的情況明顯增加（圖5E），證實(shí)腦血管密度降低對(duì)組織氧合的影響。除了減少的血管生成外，敲除組小鼠腦血管的形態(tài)異常（圖5F）。

另外，通過注射10-kDa葡聚糖示蹤實(shí)驗(yàn)以及tdTomato、紅細(xì)胞標(biāo)志物Ter-119、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（Glut1）免疫染色，發(fā)現(xiàn)毛細(xì)血管泄漏，證實(shí)Kdr缺失對(duì)血管完整性的影響（圖6A-C）。而且，Kdr敲除組小鼠大腦內(nèi)皮細(xì)胞蛋白質(zhì)組成也發(fā)生了變化，BBB內(nèi)皮細(xì)胞中顯著誘導(dǎo)出了原本并不表達(dá)的質(zhì)膜囊泡相關(guān)蛋白（PLVAP）（圖6D）。在BEC-Cre介導(dǎo)的Kdr特異性敲除小鼠中，β-catenin（CTNNB1）的表達(dá)顯著減少（圖6E）。

綜合這些結(jié)果，利用BEC-Cre介導(dǎo)腦血管特異性敲除，規(guī)避了常規(guī)全身Kdr敲除的胚胎早期致死，并證明Kdr是中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管生成所必需的。VEGF信號(hào)通路調(diào)節(jié)了與BBB內(nèi)皮細(xì)胞完整性相關(guān)的基因。

圖5. Specific knockout of VEGFR2 in brain endothelial cells.

圖6. Vegfa-Vegfr2 signaling regulates BBB integrity.

這項(xiàng)研究成功構(gòu)建了心臟冠狀動(dòng)脈特異性Cre（CoEC-Cre）和大腦血管特異性Cre（BEC-Cre），并利用順序交叉遺傳靶向系統(tǒng)揭示了VEGF信號(hào)通路參與調(diào)控大腦血管新生及血腦屏障的形成。

隨著 knockin 技術(shù)的日益普及，Cre工具鼠的建立已經(jīng)變得越來越便捷；這也就使得特異性靶向的基因敲除與基因過表達(dá)可以變得越來越精細(xì)。

Dre與CrexER聯(lián)用的這種新的順序交叉遺傳靶向系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)在特定細(xì)胞群體中進(jìn)行精確的基因操作，為組織特異性基因操作提供了一個(gè)有效的策略，可以廣泛地應(yīng)用到其他生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。是不是很妙呢？

南模生物利用CRISPR基因編輯技術(shù)和ES細(xì)胞打靶技術(shù)，為該研究構(gòu)建了包括：Nrg1-CrexER, Nrg1-CreER, Wt1-CrexER, Tie2-Dre, Mfsd2a-CrexER 在內(nèi)的多種工具小鼠模型。

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