頂空氣相色譜法測(cè)定阿米舒必利中有機(jī)溶劑殘留量

1.前言

人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議( InternationalConference of Harmonizition ICH)對(duì)藥品殘留溶劑有明確的定義以及相關(guān)的指導(dǎo)原則。 ICH 將藥品生產(chǎn)及純化過程中常用的69 種有機(jī)溶劑按照對(duì)人體和環(huán)境的危害程度分為4類。第I類溶劑是指已知可以致癌并被強(qiáng)烈懷疑對(duì)人和環(huán)境有害的溶劑, 其殘留量必須控制在規(guī)定的范圍內(nèi)；第II類溶劑是指無基因毒性但有動(dòng)物致癌性的溶劑；第3類溶劑是指對(duì)人體低毒的溶劑；第4類是尚無足夠毒理學(xué)資料的溶劑（1-3）。阿米舒必利在提取過程中使用了有機(jī)溶劑甲醇和丙酮，按照上述指導(dǎo)原則，甲醇為第二類溶劑，其含量不能超過0.3%；丙酮為第三類溶劑，其含量不能超過0.5%。

本文介紹了用賽默飛世爾氣相色譜儀 (帶FID檢測(cè)器)和Triplus頂空自動(dòng)進(jìn)樣器分析阿米舒必利中這兩種有機(jī)溶劑殘留的分析方法，方法學(xué)的驗(yàn)證表明，該方法準(zhǔn)確有效。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1 儀器和試劑

Trace GC氣相色譜儀（賽默飛世爾科技 Thermo Fisher Scientific公司），帶FID檢測(cè)器；色譜柱為TR-V1 (30m x.25 mm x 3μm)； Triplus HS自動(dòng)進(jìn)樣器（賽默飛世爾科技Thermo Fisher Scientifc公司）甲醇和丙酮 (色譜純)購(gòu)置于sigma公司； N， N-二甲基甲酰胺 (DMF，分析純)。

2.2 色譜條件

程序升溫：初始溫度:40 ℃(60 min), 升溫速率:30 ℃/min至200 ℃（3min）
載氣：恒流模式，流速為3ml/min
進(jìn)樣口： 150℃，分流進(jìn)樣，分流比為10： 1
檢測(cè)器溫度： 250℃
頂空參數(shù)設(shè)置：
孵化器溫度： 75℃
孵化時(shí)間： 30min
進(jìn)樣量： 1ml

3.結(jié)果與討論

3.1系統(tǒng)適應(yīng)性

因待測(cè)藥品的殘留溶劑主要是甲醇和丙酮，因此選擇上述2種有機(jī)溶劑，溶解在DMF中考察系統(tǒng)適用性，典型色譜圖見圖1。結(jié)果顯示，在上述色譜條件下，各溶劑分離完全。

圖1

3.2 頂空參數(shù)優(yōu)化

3.2.1 孵化器溫度

分別取5mg甲醇和丙酮，溶于一定量的DMF中，使溶液的最終體積為5ml。平行制備4份相同濃度的待測(cè)樣品，將孵化器的溫度分別設(shè)置為65℃， 75℃，85℃和95℃，以此判斷不同孵化時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。結(jié)果（如圖2）表明，隨著孵化溫度的升高，丙酮的峰面積也在增加，但是甲醇的響應(yīng)卻是在75℃時(shí)為最高，這與國(guó)家藥典中推薦的孵化溫度相一致（75℃~85℃）。并且，由于阿米舒必利的化學(xué)名為4-氨基-N-[(1-乙基-2-吡咯)甲基]-5-已砜基-2-甲氧基苯甲酰胺，黃仕璋等(4) 通過研究表明，含甲氧基的樣品在較高頂空溫度下降解產(chǎn)生甲醇，而裂解速率主要受溫度影響，隨著樣品孵化溫度的增高，甲醇的含量也會(huì)顯著的增高，因而影響了真實(shí)的檢測(cè)結(jié)果。因此在檢測(cè)時(shí)，我們將孵化器的溫度設(shè)為75℃。

3.2.2 孵化時(shí)間

分別取5mg甲醇和丙酮，溶于一定量的DMF中，使溶液的最終體積為5ml。平行制備4份相同濃度的待測(cè)樣品，將孵化器的溫度分別設(shè)置為10min， 20min， 30min和40min，以此判斷不同孵化時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。結(jié)果（如圖3）表明，隨著孵化時(shí)間的升高，丙酮和甲醇的峰面積均變化不大，考慮到樣品中的有機(jī)溶劑可能需要較長(zhǎng)的時(shí)間才有利于其揮發(fā)，因此我們將孵化時(shí)間設(shè)為20min。

3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和精密度

本方法采用外標(biāo)法定量，由于做頂空進(jìn)樣，考慮到不同樣品體積對(duì)氣體的膨脹有影響，所以這里以目標(biāo)組分的峰面積Y對(duì)相應(yīng)組分的絕對(duì)重量做標(biāo)準(zhǔn)曲線（5mg、 1mg、 500ug、 100ug和50ug），圖4A和B顯示，在這個(gè)儀器方法上甲醇和丙酮都有非常好的線性關(guān)系。以500ug為例，按信噪比為3計(jì)算得到甲醇的檢出限為1.5ug, 丙酮的檢出限1ug。配置甲醇和丙酮均為500ug平行的標(biāo)樣5個(gè)，計(jì)算方法的重現(xiàn)性，得到甲醇的RSD值為3.76%，丙酮的RSD值為1.39。

3.4 樣品檢測(cè)

精密稱取1g樣品，用10ml容量瓶定容，取5ml放入頂空瓶中，按照上述方法進(jìn)行樣品檢測(cè)，每個(gè)樣品平行進(jìn)四次（譜圖如圖5所示），結(jié)果如下表所示。按照ICH的標(biāo)準(zhǔn)，甲醇的為第二類溶劑，含量不能超過0.3%，丙酮屬于第三類溶劑，含量不能超過0.5%，待測(cè)樣品中的溶劑殘留經(jīng)檢測(cè)分別為甲醇0.004%和丙酮0.05%，符合ICH的標(biāo)準(zhǔn)。

3.5 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取上述樣品粉末0.5g，準(zhǔn)確加入500ug甲醇和丙酮，最后用DMF定容到5ml，之后進(jìn)行樣品檢測(cè)，每個(gè)樣品測(cè)定三次 (樣品加標(biāo)如圖6所示)，最終測(cè)得甲醇和丙酮的平均回收率分別為98.4%和101.7%。

3.6 注意事項(xiàng)

所有樣品溶解以及標(biāo)樣配置的過程需在冰上進(jìn)行操作，防止有機(jī)溶劑揮發(fā)所引起的結(jié)果誤差。

參考文獻(xiàn)：

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