想洞悉細(xì)胞線粒體內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)？全新SIM超分辨技術(shù)有話講！
生物圈的小伙伴肯定還記得前段時(shí)間的一則刷屏新聞：
北京大學(xué)陳良怡教授團(tuán)隊(duì)和華中科技大學(xué)譚山教授團(tuán)隊(duì)合作，成功發(fā)明了一種新型結(jié)構(gòu)光照明超分辨顯微成像技術(shù)——海森結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡。研究成果于高水平學(xué)術(shù)期刊Nature Biotechnology（IF=41.67）進(jìn)行了發(fā)表。
之所以轟動(dòng)，是因?yàn)樵摷夹g(shù)擁有超高的采集速度和靈敏度，以及低于共聚焦和其他超分辨成像方法（STORM/STED等）千分之一以上的光毒性和光漂白效應(yīng)，成為了目前進(jìn)行超長時(shí)間活細(xì)胞高速超分辨成像的利器。
而且，這個(gè)牛氣哄哄的技術(shù)一經(jīng)發(fā)明，便已經(jīng)奪得生物成像領(lǐng)域的好幾個(gè)“首次”：
· 首次在活體細(xì)胞中清晰解析出線粒體的內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，以及線粒體融合與裂解過程中內(nèi)膜的動(dòng)態(tài)變化；
· 首次觀察到活體細(xì)胞中線粒體嵴與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的相互作用與運(yùn)動(dòng)；
· 首次通過連續(xù)成像的形式，捕捉到了完整的囊泡分泌與融合過程中的孔道及融合中間態(tài)。
那么究竟這臺(tái)高大上儀器是怎樣被研發(fā)而出？它爆炸性的技能點(diǎn)具體又是怎樣？接下來我們就來深度解讀一下啦！
實(shí)時(shí)觀察線粒體融合分裂及內(nèi)膜動(dòng)態(tài)變化
從1994年Stefen W. Hell提出STED顯微鏡理論，到2014年三位科學(xué)家因?yàn)槌直骘@微技術(shù)獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。短短20年間，超分辨成像可以說是聲名大噪，各種超分辨成像平臺(tái)也幾乎成為了各大高校研究所的必備。
但是，一個(gè)奇怪的現(xiàn)象讓北京大學(xué)的陳良怡教授產(chǎn)生了疑惑：雖然遍地開花，但由超分辨成像技術(shù)所帶來的生物學(xué)新發(fā)現(xiàn)卻屈指可數(shù)。究竟是何種原因，限制了超分辨顯微成像在生物研究領(lǐng)域大顯身手？
目前，主流的超分辨成像技術(shù)主要有三類：
1、基于可隨機(jī)開關(guān)的單分子熒光閃爍定位的STORM/PALM方法；
2、基于熒光蛋白受激發(fā)射損耗原理的STED方法；
3、基于結(jié)構(gòu)光調(diào)制與解調(diào)制圖像信息的SIM方法。
其中，STED通過純光學(xué)方法能夠獲得50 nm甚至更低的分辨率，不通過算法擬合重建，成像速率取決于共聚焦平臺(tái)的振鏡掃描速率。但是其明顯的弊端在于用于激發(fā)樣品的光功率是最強(qiáng)的（MW/cm2數(shù)量級，相當(dāng)于100萬個(gè)太陽同時(shí)在天上炙烤你的皮膚）。如此一來，既會(huì)對樣品產(chǎn)生積累的光毒性，又容易在長時(shí)間的活細(xì)胞觀察過程中使樣品熒光淬滅。
STORM/PALM相對于STED來說光照條件要稍微溫和一些（kW/cm2數(shù)量級，大概也就相當(dāng)于1000個(gè)太陽吧），分辨率也能到50 nm以下。但由于獲得一張超分辨圖片需要基于成百上千張?jiān)嫉膯畏肿娱W爍圖像，并通過算法擬合重建。所以成像的速度也是制約其發(fā)展的重要原因。同時(shí)，STORM/PALM對于熒光標(biāo)記物的選擇是非�？量痰模虼藥缀醪荒茉谕粋�(gè)樣品上實(shí)現(xiàn)多個(gè)蛋白的超分辨觀察。
但是另外一種超分辨率方法，基于莫爾條紋效應(yīng)的SIM就不一樣了！
基于傅里葉光學(xué)和算法重建，SIM能夠用最低的光功率（W/cm2數(shù)量級）獲得長時(shí)間的活細(xì)胞超分辨圖像。同時(shí)它對熒光標(biāo)記物也無選擇性，可以輕松實(shí)現(xiàn)多標(biāo)記物觀察。最重要的是由于重建一張超分辨圖像只需要9-15張?jiān)紙D像，因此SIM也是在相同成像視野下最快的超分辨方法。該方法非常適合生物樣品中快速生物學(xué)過程的記錄，如細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)和細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)學(xué)研究、離子成像以及神經(jīng)放電等等。
不過SIM也有一個(gè)明顯的劣勢——只能達(dá)到100 nm左右的分辨率。雖然使用非線性SIM成像可以使分辨率媲美其他兩種方法，但代價(jià)則是需要使用很強(qiáng)的激發(fā)光，失去了活細(xì)胞觀察的優(yōu)勢。
看準(zhǔn)了SIM成像的優(yōu)勢，陳教授團(tuán)隊(duì)便開始著手進(jìn)行線性SIM方法的優(yōu)化。為了達(dá)到88 nm，188 Hz的優(yōu)良性能，他們主要在以下幾個(gè)方面做出了努力：
1、使用高NA的物鏡，提升極限分辨率，盡可能多的接收光信號(hào)
提升成像系統(tǒng)的NA值一直是提高系統(tǒng)分辨率的不二法門。通過使用NA值高達(dá)1.7的油鏡，再加上SIM方法本身的2倍分辨率提升，Hessian-SIM系統(tǒng)的最佳分辨率可以達(dá)到88 nm。
使用更高數(shù)值孔徑的物鏡可以明顯提升光學(xué)系統(tǒng)的OTF,使其在傅里葉頻域空間能探測更高頻的信號(hào)。在二維的頻域空間中，越靠近中央亮點(diǎn)的區(qū)域，代表圖像越低頻的部分，可以看到NA值越高越能覆蓋到邊緣的高頻區(qū)域。
同時(shí)，NA值越大的物鏡接受光信號(hào)的能力也越大，這樣就可以最大限度降低激發(fā)光功率，或者使用盡可能短的曝光時(shí)間以期達(dá)到高速成像的目的。
2、改良了傳統(tǒng)SIM方法產(chǎn)生衍射光柵的方法
2D-SIM成像需要通過產(chǎn)生兩束互相干涉的光來形成三種不同偏振方向，且光強(qiáng)在空間上呈正弦變化的結(jié)構(gòu)光。在傳統(tǒng)的SIM成像方法中，這一過程除了要依靠液晶硅基的空間光調(diào)制器（LCOS-SLM）對光相位進(jìn)行調(diào)制之外，還需要一種特殊的光學(xué)器件來改變光的偏振方向——旋偏器（polarization rotator）。但這個(gè)器件本身的響應(yīng)時(shí)間是ms數(shù)量級的，所以成為了高速SIM成像的一個(gè)限制因素。
而陳教授團(tuán)隊(duì)自主設(shè)計(jì)了新的偏振旋轉(zhuǎn)玻片陣列，使其可以更好的配合SLM和相機(jī)曝光，使得激發(fā)光的偏振方向做最快速的切換。
圖中PR所示部分即旋偏器，b中上下兩部分的雙向箭頭分別表示入射光和經(jīng)過旋偏器后光的偏振方向。
3、極大程度的降低圖像采集和重構(gòu)過程中產(chǎn)生的Artifact
我們都知道在SIM方法中，算法重建也起著相當(dāng)重要的作用。但是在解卷積的算法中，計(jì)算機(jī)或者說軟件對信號(hào)和噪音的解讀是“一視同仁”的。換句話說它很難自己告訴自己哪些地方是信號(hào)，哪些地方是噪聲。
所以，為了將SIM成像的低光漂泊和光毒性優(yōu)點(diǎn)發(fā)揮到極致，不得不克服在弱光低信噪比情況下算法所重建出來的Artifact。為了應(yīng)對相應(yīng)的問題，譚山教授團(tuán)隊(duì)提出了一種能夠基于生物樣品結(jié)構(gòu)相關(guān)的先驗(yàn)知識(shí)來屏蔽噪音信號(hào)的重建算法——Hessian解卷積算法。
這個(gè)就是Hessian解卷積算法的最優(yōu)解形式，以及其中的Hessian罰分矩陣（別問，小編也不懂̷̷扶額.jpg）
我們知道，樣品信號(hào)除了在xy平面上具有連續(xù)結(jié)構(gòu)之外，當(dāng)其每一幀的運(yùn)動(dòng)距離小于系統(tǒng)空間分辨率時(shí)，它在xyt的時(shí)空上也是連續(xù)的。相反，背景噪聲在重建后形成的Artifact則是時(shí)空分布隨機(jī)和無特定形態(tài)的，因此通過這一標(biāo)準(zhǔn)就可以很好的去除這些Artifact。
通過比較Hessian解卷積算法和其他幾種經(jīng)典和常見的SIM重構(gòu)算法（如Wiener、TV-SIM、fairSIM等），發(fā)現(xiàn)高速記錄時(shí)的低信噪比圖像在使用除Hessian之外的算法進(jìn)行重構(gòu)之后，均會(huì)有不同程度的Artifact產(chǎn)生（同樣的情況在長時(shí)間激發(fā)引起的光漂泊現(xiàn)象中也能夠觀察到），而Hessian算法的表現(xiàn)則一如既往的好。
不同SIM解卷積算法重建超分辨圖像的效果對比：樣品為Lifeact-EGFP標(biāo)記的微絲，曝光時(shí)間為0.5 ms，每組左圖為0 s時(shí)刻的圖像，右圖為60 s時(shí)刻的圖像。
此外，該系統(tǒng)也擁有超高的時(shí)間分辨率，并達(dá)到了188 Hz的幀速。有著這樣的性能表現(xiàn)，其關(guān)鍵硬件——相機(jī)則應(yīng)實(shí)現(xiàn)9倍以上的采集速度。
使用了第二代前照式sCMOS芯片，可在512×100的分辨率下進(jìn)行2000幀/s的采集——作為目前科研領(lǐng)域最高速的CMOS相機(jī)，濱松sCMOS ORCA-Flash4.0 V3便是該系統(tǒng)的選擇。
雖然使用前照式芯片是保證成像速率的必要之舉，但是也并沒在靈敏度上大打折扣。濱松Flash4.0相機(jī)具有業(yè)內(nèi)最低的讀出噪音(0.8 e-)，同時(shí)82%的高量子效率，可保證在低曝光時(shí)間的條件下得到相對高的圖像信噪比。
針對現(xiàn)在流行的超分辨成像技術(shù)，其相機(jī)芯片也做了更加精細(xì)的定量校準(zhǔn)，將像素之間的光響應(yīng)差異(PRNU)和噪音的不均一性(DSNU)都降到最低。
值得一提的是，F(xiàn)lash4.0輸出的圖像一直以來都是未經(jīng)任何處理的原始圖像，不在原始數(shù)據(jù)層面對噪音或hotpixel進(jìn)行插值或?yàn)V波。這樣在輸入到各種重建或擬合的算法模型中才能得到準(zhǔn)確的結(jié)果，避免了再人為引入其他Artifacts。
通過硬件創(chuàng)新和算法優(yōu)化以及精確的時(shí)空信號(hào)控制，Hessian-SIM可以在低于傳統(tǒng)SIM激發(fā)光功率的條件下，以更低的曝光時(shí)間進(jìn)行圖像采集，并對樣品的原始信息高度還原。從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)變化的高速連續(xù)記錄，或者對活細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的長時(shí)觀察。
在相同的光照條件下，以1 Hz頻率進(jìn)行拍攝1 h，傳統(tǒng)SIM使用7 ms曝光，而Hessian-SIM使用0.5 ms曝光。
陳良怡教授團(tuán)隊(duì)一直致力于對高端的生物成像技術(shù)進(jìn)行革新性的改良和研發(fā)。除了解決超分辨成像的長時(shí)間或高速問題之外，早在2014年就與程和平院士就將雙光子和光片成像技術(shù)結(jié)合開發(fā)出激發(fā)光片范圍更大同時(shí)z軸分辨率更高的成像技術(shù)（Zong W, Chen L, et al.CellRes. 2014 Sep 26. doi: 10.1038/cr.2014.124）；2017年又針對雙光子在神經(jīng)生物學(xué)應(yīng)用中的靈活性，開發(fā)出了現(xiàn)今質(zhì)量最小的頭戴式微型雙光子顯微鏡（Zong W, Wu R, Li M, ChenL, et al. Nat Methods. 2017 May 29. doi: 10.1038/nmeth.4305），解決了行為學(xué)和活體顯微觀察的矛盾。
除了科研相機(jī)外，濱松的光電器件，如光電倍增管等，也參與到了這些重要研究中。以淬煉了60余年的光電探測技術(shù)，為發(fā)展更好的科研成像技術(shù)，貢獻(xiàn)出濱松的一份力量。
