FITC標記反應原理

FITC標記反應原理：
        蛋白質分子的賴氨酸殘基的游離氨基可與FITC發(fā)生親核反應，形成硫脲連接而共價結合。
 操作過程：
實驗前準備：

1.   仔細閱讀使用說明書。
2.   計算待使用FITC的量。
3.   提前20 min從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫（注：不需要用到的FITC繼續(xù)放置冰箱中）。
4.   溶解FITC：加入30 μL DMF至FITC瓶中，靜置10 min，待其充分溶解，此時FITC的濃度為10 mg/mL。

操作步驟：（本操作步驟按照1 mg的量進行標記）

1.   取1 mg待標記抗體于Filtration tube中，并加入相應體積的 Labeling Buffer至總體積為0.5 mL，12,000× g離心10 min。（注：①Filtration tube的最大體積為0.5 mL。 ②待標記抗體濃度低時，可先超濾離心一次。）
2.   加入15 μL FITC 和適量Labeling Buffer至上述Filtration tube中，使抗體的終濃度為2 mg/mL，并輕輕吹打混勻。放入37 ℃恒溫箱中避光溫育60 min。
3.   12,000× g離心10 min。
4.   加入適量Labeling Buffer至上述Filtration tube中，使終體積為0.5 mL，并輕輕吹打混勻，12,000× g離心10 min。并重復操作一次。
5.   加0.2 mL Labeling Buffer至Filtration tube中，輕輕吹打。將濾芯倒轉放置于另一個離心管中，6,000× g離心10 min。
6.   收集離心管中的溶液，即為FITC標記的抗體。

注意事項：

1.   本試劑盒也可標記其它含有氨基（NH2-）的抗原、HRP、多肽，具體標記比例根據(jù)待標記物中氨基的數(shù)量確定。
2.   DMF要密封干燥保存，使用完立即用封口膜封緊。
3.   操作步驟5中，可用Labeling Buffer作為回收標記抗體的緩沖液，也可使用其它任何緩沖液或保護劑。
4.   本試劑盒未開封前的有效期為一年，請在有效期內使用。
5.   本試劑盒提供的為10 kDa的Filtration tube，標記抗原或多肽請注意分子量的大小。
6.   在步驟2中，標記其它抗體時，我們應先控制抗體的終濃度為2 mg/mL，然后再根據(jù)抗體的量計算應加入FITC的體積。
7.   要確定在偶聯(lián)中不引入游離氨基（Tris,氨及疊氮鈉均可與FITC反應，因此會降低蛋白與FITC的偶聯(lián)率）