Microsart® AMP支原體試劑盒的驗證測試
Alexandra Scholz (alexandra.scholz@sartorius.com)
Stephanie Schweizer (stephanie.schweizer@sartorius.com)
引言
作為世界上最小的細菌之一，支原體能夠獨立繁殖。它們屬于柔膜菌綱，生長非常緩慢，且為寄生。細胞培養(yǎng)物的污染仍是一個主要問題。一系列生理和生化參數受細胞培養(yǎng)物中支原體的影響。支原體感染會導致細胞的代謝、生長、活力、大分子合成、形態(tài)等發(fā)生變化，因此對細胞培養(yǎng)物進行靈敏的常規(guī)污染檢測是必不可少的。
傳統(tǒng)的基于生長的方法需要培養(yǎng)至少28天才能確定地排除支原體污染。相比之下，核酸擴增技術（NAT）可將獲得結果的時間縮短到幾個小時。作為培養(yǎng)法的一種替代方法，必須證明NAT測試系統(tǒng)能夠檢測10 CFU/mL的支原體。為此，本研究中對三種不同的支原體PCR試劑盒進行了測試，測試其在DMEM培養(yǎng)基中檢測不高于10 CFU/ml支原體的能力。
實驗設置和結果
在本次研究中，使用Microsart® AMP支原體試劑盒（包括樣品制備）和Microsart® AMP提取試劑盒（Sartorius Stedim Biotech GmbH）和其他兩種支原體檢測試劑盒進行了驗證測試，這兩種檢測試劑盒也基于DNA分離和隨后的實時熒光定量PCR分析。使用10CFU靈敏度標準精氨酸支原體（NCTC編號10129）、口腔支原體（NCTC編號10112）和柑橘螺原體（NCTC編號10164）（Sartorius Stedim Biotech GmbH）作為測試材料。這些凍干標準品可以通過加入1 ml樣品基質輕松再水化，達到10 CFU/ml的濃度。這些制劑旨在用于安全可靠地對支原體PCR分析進行驗證。在這些比較研究中，使用含有5% FCS的DMEM培養(yǎng)基作為樣品基質。
對于全部三種測定，根據制造商的手冊進行DNA分離過程和隨后的PCR設定。Microsart® AMP提取試劑盒基于方便的二氧化硅柱方案，可在30分鐘內完成。競爭產品的DNA分離基于磁珠法使DNA沉淀。在評估的三種PCR檢測方法中，兩種包括高度特異性的TaqMan探針；其中之一是Microsart® AMP支原體檢測試劑盒。第三種檢測方法的檢測混合物中含有SYBR Green，使得在DNA擴增循環(huán)后需要進行融解曲線分析，以區(qū)分非特異性擴增DNA和支原體擴增DNA。
每種樣品（精氨酸支原體、口腔支原體和柑橘螺原體）用每種試劑盒測試四次，包括DNA分離、聚合酶鏈式反應和數據分析的全過程。結果列于表1中。
表1：使用三家不同供應商的試劑盒對DMEM培養(yǎng)基 + 5% FCS和10 CFU/ml 精氨酸支原體|口腔支原體|柑橘螺原體進行PCR測試的結果
圖 1：使用Microsart® AMP支原體試劑盒的擴增曲線，使用精氨酸支原體樣品（10 CFU/ml，在DMEM培養(yǎng)基 + 5% FCS中），PCR Cycler MxPro 3005P
結論
在這些研究中，使用包括另外兩家供應商支原體實時熒光定量PCR試劑盒（包括樣品制備）對賽多利斯 Microsart® AMP提取試劑盒和Microsart® AMP支原體試劑盒進行了驗證測試。
在隨后的PCR分析中，36個DNA提取物均顯示陽性信號。因此說明所有測試產品都能以至少10 CFU/ml的靈敏度檢測支原體污染。
如果仔細觀察一家供應商的結果中的標準偏差，首先使用Microsart® AMP提取試劑盒，然后用Microsart® AMP支原體試劑盒進行擴增，則會盡可能地減小結果的可變性，提高重現(xiàn)性。PCR試劑盒，主要是三種不同的樣品制備方法可能導致出現(xiàn)重現(xiàn)性差異。已知二氧化硅膜方法即使在處理高度復雜的樣品基質時也非常穩(wěn)健和可靠。DNA沉淀法或磁珠法往往更費力且不可靠。
另一個有助于Microsart®支原體產品適用范圍可靠性的事實是，所有PCR試劑都可以儲存于4至8°C條件下。因此，如果冷鏈短暫中斷，不會導致試劑發(fā)生融化，否則會對PCR檢測的靈敏度產生負面影響。相反，供應商T和供應商R的支原體檢測試劑盒必須在-20°C冷凍保存。當計劃用這些產品進行測試時，必須記住PCR試劑解凍的額外等待時間。此外，必須考慮如果必須在-20°C儲存的試劑盒在一次PCR運行中未完全用完，反復凍融也會對PCR結果產生負面影響。
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