環(huán)介導等溫擴增技術的原理與應用

原理與應用

環(huán)介導等溫擴增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）技術是日本學者Notomi T于2000年發(fā)明的一種新的DNA擴增技術，該方法能夠高效、特異、快速的在等溫條件下完成。通過一系列的鏈置換擴增反應，該方法能夠在1h內就可以將靶基因擴增109倍，當靶基因為RNA時，該方法還可以通過在反應體系中添加反轉錄酶而實現對RNA的擴增；在LAMP反應中，會有大量的DNA合成，因此會產生很多焦磷酸根離子，這些焦磷酸根離子可以結合溶液中的二價Mg2+形成不容的焦磷酸鹽，便于對反應結果的觀測，使擴增和檢測一步就可以完成，大大提高檢測效率。

1.1 LAMP反應的基本原理

該技術根據靶基因的6個區(qū)域設計出4條引物，包括兩條內引物和兩條外引物（如下圖），其中內引物由靶序列正義鏈和反義鏈的兩個特異區(qū)域組成，利用DNA鏈在60-65℃的恒溫條件下處于解鏈和退火的動態(tài)平衡狀態(tài)，在DNA聚合酶的驅動下結合靶序列啟動DNA合成，由于內引物同時和雙鏈互補，因此是形成環(huán)狀結構的主要因素；外引物與內引物前端的序列互補，通過鏈置換DNA聚合酶的作用置換下內引物合成的DNA鏈并且合成自身DNA，被置換的鏈自身形成莖-環(huán)結構接著與內引物結合進行擴增和鏈置換，新合成的莖-環(huán)結構的長度是原來的二倍，如此經過滾環(huán)擴增之后形成的產物是周而復始的插入靶序列的不同長度的莖-環(huán)結構的DNA鏈，即由很多重復的環(huán)組成的花椰菜結構。為了提高反應速度，還可以通過引入兩條環(huán)引物加快反應，環(huán)引物與合成過程中形成的環(huán)狀區(qū)域互補，增加了在LAMP反應中DNA合成的起點數量，可大大縮短檢測時間，提高檢測效率。

R方法不同之處在于無需加熱到使雙鏈DNA解旋到兩條單鏈的變性溫度就可以驅動反應的進行，針對靶基因的6個特性性區(qū)域的引物結構如下圖所示，其具體合成步驟如下：

第1階段為起始階段：

第一步：內引物FIP與模板鏈復性結合，以FIP引物中的F2區(qū)域3’端為起點，在Bst DNA聚合酶的鏈置換活性的驅動下合成與靶序列互補的一條新鏈。

第二步：F3引物結合位于FIP前端的F3c區(qū)域開始鏈置換DNA合成，將之前FIP合成的序列置換下來，同時與模板鏈相互配對，合成自身序列，形成以F3引物為起點的雙鏈DNA；被F3引物置換下來的鏈成為一條單鏈，由于這條單鏈上存在自身互補的序列，因此，FIP引物5’F1c區(qū)域與這條單鏈上的F1區(qū)域互補，自身配對形成莖-環(huán)結構。

第三步：下游引物BIP中的B2區(qū)域與被置換下來的這條單鏈相結合開始DNA合成。通過這一過程，之前上游形成的環(huán)狀結構恢復為線性結構，隨后由下游的B3引物將其和成的單鏈置換下來；同時也進行自身序列的合成，從而形成由F1到B3的雙鏈DNA。

第四步：被置換下來的單鏈DNA兩端分別與內引物相結合，因而可以與自身配對在兩端分別形成莖-環(huán)結構，被稱為啞鈴結構，該結構是LAMP擴增循環(huán)的起始結構。

第2階段是擴增循環(huán)階段：

第一步：以上述的啞鈴結構F1的3’末端進行合成延伸，并且打開5’末端的環(huán)。

第二步：以莖環(huán)狀結構為模板，FIP與莖環(huán)的F2c區(qū)結合，開始鏈置換合成；同時3’末端B1c和B1區(qū)域互補，在3’末端形成莖環(huán)結構，以自身結構為模版，B1的3’端區(qū)域為起點進行DNA合成，釋放出帶有FIP的互補序列。

第三步：上一步中形成長短不一的2條新莖環(huán)狀結構的DNA，接著BIP引物上的B2與它們雜交，啟動新一輪擴增。

1.3. LAMP引物設計原則

LAMP技術擴增基因的關鍵是設計出4條特異性的引物，從需要擴增的靶序列中選出F3c、F2c、F1c、B1、B2、B3 六個特定的區(qū)域，利用在引物設計軟件Primer Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/e/)即可完成；在引物設計過程中，為了得到理想的引物，需要注意以下幾點：

00001. 被擴增的靶序列長度最好不要超過200bp。

00002. 內引物的末端最好不要富含AT堿基對，其末端穩(wěn)定性自由能（△G）值應該小于-4kcal/mol。

00003. 每條引物的Tm值應該在55~65℃之間，最大限度的發(fā)揮酶的活性。

00004. 針對靶序列的各個區(qū)域，F2區(qū)域的5’到F1區(qū)域的5’末端以及B2區(qū)域的5’末端到B1區(qū)域的 5’末端之間的距離最好在40~60bp；F2區(qū)域的5’末端到B2區(qū)域的5’末端之間的距離最好在120bp~180bp。

1.4 LAMP反應的結果觀察

LAMP在反應過程中，由于其反應效率高，速度快等特點，在反應中dNTP會解離出大量的焦磷酸根離子，與溶液中的鎂離子相結合生成焦磷酸鎂白色沉淀，而焦磷酸鎂的生成量和DNA的擴增量呈正相關，雖然普通的PCR也會產生焦磷酸鹽，但其生成量很少，不能用于結果觀察，因此，生成焦磷酸鎂白色沉淀是LAMP反應所特有的，并且可以將這一特性運用到反應結果的檢測當中去。

根據LAMP反應的這一特性，可以在反應體系中添加金屬離子絡合劑或金屬離子指示劑，通過其結合不同金屬離子而呈現不同顏色的這一特性來判斷反應是否進行。鈣黃綠素（Calcein）就是一中金屬離子絡合劑，它需要和熒光淬滅劑Mn2+一起使用，當反應體系中存在這兩種物質時，隨著陽性反應的進行生成大量的焦磷酸根離子，與鈣黃綠素競爭結合Mn2+，從而使Calcein缺少了Mn2+而開始出現熒光，當反應結束后，陽性結果為淺綠色；在紫外燈下顯熒光，而陰性反則顏色不變，仍為橙黃色。羥基萘酚藍（HNB）是一種金屬離子指示劑，當溶液中存在Mg2+時，顏色為紫紅色，而隨著反應的進行，由于大量焦磷酸根離子的生成與Mg2+相結合，消耗了溶液中的Mg2+，顏色會由紫紅色變?yōu)樘焖{色；這兩種試劑都可以通過反應體系顏色的變化來判斷反應是否進行，實現對反應的可視化觀察，大大提高了反應的檢測效率。

LAMP反應的結果是擴增出不同大小的DNA片段，同樣也可以用最普通的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，向反應產物中添加EB等核酸染料，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈照射下能夠觀察到大小不等的梯度條帶。

實時濁度法是利用實時濁度儀通過對反應過程中溶液的濁度進行測量從而實現對LAMP反應進行實時監(jiān)控，可以在電腦上直接進行結果分析，可以實現對初始模版DNA量的定量擴增；同時也可以對引物及其工作濃度，反應時間、溫度等條件進行優(yōu)化，從而為LAMP反應提供最優(yōu)的反應環(huán)境。

2  LAMP檢測方法的應用

LAMP技術自2000年出現以來，以其快速、精確、高效的特性經被廣泛的應用。這項技術已經發(fā)展到商業(yè)化的檢測試劑盒中，包括細菌和病毒的檢測；這項技術由于其成本低，能夠應用于發(fā)展中國家的基層的實驗室中，尤其是傳染病比較嚴重的地區(qū)。

Hara-Kudo 等建立了針對沙門氏菌的LAMP檢測方法，并且與PCR方法相比較，其敏感性要高于PCR方法；隨后，他們又針對大腸桿菌的VT基因建立了商業(yè)化的LAMP檢測試劑盒，實現了對大腸桿菌的LAMP檢測。Ito等報道了針對流感病毒的LAMP引物，建立了對流感病毒的LAMP檢測方法；該方法的敏感性好、特異性高。Imai等人建立了檢測禽流感H5型的RT-LAMP檢測方法；該方法第一次報道了能夠從野生禽類咽拭紙樣本中檢測出H5禽流感病毒，并且不能夠對人流感病毒的RNA進行擴增；其敏感性是普通RT-PCR敏感性的100倍。Nkouawa 等根據 L 組織蛋白酶樣半肌氨酸膚酶基因建立絳蟲的LAMP診斷方法，可以用于區(qū)分豬帶絳蟲和牛帶絳蟲以及亞洲帶絳蟲。

由于病原微生物都有適應和變異的功能，因此不斷會有新的感染性疾病的出現，能夠快速、高效、特異、便捷地鑒定出這些病毒，對疫病的防控就顯的尤為重要。LAMP檢測技術作為一種基于核酸擴增的新的方法為鑒別微生物病原提供了很大的幫助，其操作方法簡單、反應時間短，只需要在恒溫的水浴鍋中就可以完成反應，大大降低了檢測成本，該方法已經在不同的領域針對不同的病原微生物取得了良好的效果，并且還有很多已經開發(fā)出來了相應的LAMP檢測試劑盒，為疾病的鑒別診斷、預防控制做出了很大的貢獻。

RT-LAMP（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification）

LAMP也同樣適用于RNA模板，在反轉錄酶和DNA聚合酶的共同作用下，實現RNA的一步擴增，無需像RT-PCR，必須經過反轉錄過程。LAMP反應溫度在60-65 ℃，在此溫度下AMV反轉錄酶同樣具有較高的活性，對于RNA模板，其反應條件與DNA模版反應條件相同，只需在反應體系中加入AMV反轉錄酶；同時，也應注意環(huán)境中的RNA酶對于RNA的降解作用，在進行LAMP反應之前RNA在反轉錄酶的作用下首先合成cDNA，之后在Bst DNA聚合酶的作用下啟動鏈置換反應，開始LAMP反應。

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