數(shù)字PCR技術(shù)的發(fā)展和原理

數(shù)字PCR即Digital PCR（dPCR)，它是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)。相較于qPCR，數(shù)字PCR可讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個(gè)數(shù)，是對(duì)起始樣品的絕對(duì)定量。

在定量PCR時(shí)，我們常常糾結(jié)一個(gè)問(wèn)題，究竟是相對(duì)定量還是絕對(duì)定量呢？如今，你無(wú)需糾結(jié)了，因?yàn)閿?shù)字PCR（digital PCR）來(lái)了。盡管這兩種技術(shù)有些類似，都是估計(jì)起始樣品中的核酸量，但它們有一個(gè)重要的區(qū)別。定量PCR是依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線或參照基因來(lái)測(cè)定核酸量，而數(shù)字PCR則讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個(gè)數(shù)，是對(duì)起始樣品的絕對(duì)定量。因此特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域：拷貝數(shù)變異、突變檢測(cè)、基因相對(duì)表達(dá)研究（如等位基因不平衡表達(dá)）、二代測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證、miRNA表達(dá)分析、單細(xì)胞基因表達(dá)分析等。

技術(shù)發(fā)展：

20世紀(jì)末，Vogelstein 等提出數(shù)字PCR( digitalPCR，dPCR) 的概念，通過(guò)將一個(gè)樣本分成幾十到幾萬(wàn)份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個(gè)單元至多包含一個(gè)拷貝的目標(biāo)分子( DNA 模板) ，在每個(gè)反應(yīng)單元中分別對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后對(duì)各個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

數(shù)字PCR技術(shù)不斷發(fā)展，Bio-Rad、LIFE Technologies及RainDance等廠家相繼推出技術(shù)較為成熟的數(shù)字PCR產(chǎn)品。

QuantaLife公司開發(fā)出的微滴數(shù)字PCR技術(shù)。該產(chǎn)品還獲得了2011年度Frost & Sullivan北美新產(chǎn)品創(chuàng)新獎(jiǎng)。2011年10月，Bio-Rad公司收購(gòu)了QuantaLife和ddPCR技術(shù)，相繼推出了QX100、QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)。

與其他數(shù)字PCR技術(shù)不同，Bio-Rad對(duì)樣品進(jìn)行微滴化處理。據(jù)該公司基因表達(dá)部門的銷售經(jīng)理Richard Kurtz介紹，他們的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)是能夠產(chǎn)生非常均一、重復(fù)的1納升液滴。這樣的好處是每個(gè)樣品形成20,000個(gè)液滴，而其他系統(tǒng)只能分成760-3,000個(gè)部分。分得越多，則意味著分析越準(zhǔn)確。

數(shù)字PCR是一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)。當(dāng)前核酸分子的定量有三種方法，光度法基于核酸分子的吸光度來(lái)定量；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real Time PCR）基于Ct值，Ct值就是指可以檢測(cè)到熒光值對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)；數(shù)字PCR是最新的定量技術(shù)，基于單分子PCR方法來(lái)進(jìn)行計(jì)數(shù)的核酸定量，是一種絕對(duì)定量的方法。主要采用當(dāng)前分析化學(xué)熱門研究領(lǐng)域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個(gè)。這樣經(jīng)過(guò)PCR循環(huán)之后，有一個(gè)核酸分子模板的反應(yīng)器就會(huì)給出熒光信號(hào)，沒有模板的反應(yīng)器就沒有熒光信號(hào)。根據(jù)相對(duì)比例和反應(yīng)器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。

原理：

PCR實(shí)際上是一個(gè)在模板DNA、引物(模板片段兩端的已知序列)和四種脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴的酶促合成反應(yīng)，擴(kuò)增的特異性取決于引物與模板DNA的特異結(jié)合。

數(shù)字PCR(Digital PCR)儀器

伯樂生命bio-rad QX200 微滴式數(shù)字PCR (ddPCR) 系統(tǒng)可對(duì)DNA或RNA分子進(jìn)行絕對(duì)定量分析，適用于 EvaGreen 或基于探針的數(shù)字PCR應(yīng)用領(lǐng)域。

QX200 Droplet數(shù)字PCR(Digital PCR) 系統(tǒng)的應(yīng)用領(lǐng)域：

癌癥生物標(biāo)志物研究和拷貝數(shù)變異分析
以卓越的靈敏度和準(zhǔn)確度測(cè)量癌癥突變的變異程度、檢測(cè)稀有的 DNA 靶拷貝以及解析拷貝數(shù)變異狀態(tài)。
病原體檢測(cè)
精確地對(duì)靶 DNA 或 RNA 分子中的細(xì)微變化進(jìn)行定量分析，從而檢測(cè)和監(jiān)測(cè)病原體。
與新一代測(cè)序 無(wú)縫對(duì)接
無(wú)需使用標(biāo)準(zhǔn)曲線，直接對(duì) NGS 庫(kù)執(zhí)行絕對(duì)定量分析。
基因表達(dá)分析
可對(duì)少量 mRNA 和 miRNA 的細(xì)微變化進(jìn)行準(zhǔn)確及重復(fù)性極佳的檢測(cè)。
環(huán)境監(jiān)測(cè)
使用 QX200 系統(tǒng)可測(cè)試多種環(huán)境樣品，例如土壤和水。
食品檢測(cè)
采用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的 ddPCR 方法對(duì)轉(zhuǎn)基因生物體 (GMO) 進(jìn)行評(píng)估。

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