Science Immunology：狙擊腫瘤，PD-1與GITR抗體聯(lián)用竟有事半功倍之妙！
2018年11月，也就是本月初，在Science Immunology期刊中刊登的一篇為Combination cancer immunotherapy targeting PD-1and GITR can rescue CD8+ T cell dysfunction and maintain memory phenotype文章中，表明聯(lián)合使用抗PD-1抗體和抗GITR抗體促進淋巴細胞抗癌效果的機制。這種組合療法能夠顯著提高CD8+T細胞的效應子功能。它通過提高一種名為CD226的共刺激通路活性，刺激一種能夠迅速增殖的效應記憶T細胞前體的產生。這項研究揭示GITR抗體和PD-1抗體組合提高T淋巴細胞抗癌功能的分子機理，支持在臨床試驗中繼續(xù)檢驗這種組合療法的抗癌效果。下面小編帶著大家簡單回顧一下這篇文章~
抗PD-1抗體與抗GITR抗體的聯(lián)合治療
以協(xié)同方式抵抗腫瘤生長
以及瘤內CD8+ T細胞的功能障礙
首先研究者利用小鼠結腸癌模型評價抗PD-1抗體、抗GITR抗體以及抗PD-1抗體與抗GITR抗體聯(lián)用這三種方式的治療效果，發(fā)現(xiàn)抗PD-1抗體與GITR抗體聯(lián)合治療可顯著提高荷瘤小鼠生存期（如圖1A），此治療主要依賴CD8+ T細胞對腫瘤進行作用（如圖1B）。同時抗PD-1抗體與抗GITR抗體聯(lián)合作用可提高瘤內效應T細胞/調節(jié)性T細胞的比率（如圖1C-D），促進瘤內CD8+ T細胞的增殖（如圖1E-G）。
圖1. PD -1抗體與GITR抗體的聯(lián)合用藥可協(xié)同抑制小鼠腫瘤，降低T細胞功能障礙
在腫瘤免疫治療過程中，應用單細胞測序是一種非常重要的研究方法。單細胞RNA測序能夠獨立地提供每個細胞的RNA表達譜，并鑒定異質細胞群中的稀有細胞。由于在抗體藥免疫治療過程中，腫瘤組織內會出現(xiàn)TILs（腫瘤浸潤淋巴細胞），進而在癌組織及周邊形成復雜的腫瘤微環(huán)境，這種微環(huán)境是腫瘤免疫治療的關鍵。而僅對這些免疫細胞表型進行簡單分析，很難獲免疫治療長效性的機制，因此只有開展單細胞水平的RNA研究才能獲得詳盡的腫瘤免疫圖譜，為發(fā)現(xiàn)抗體藥靶點治療機制以及潛在新的腫瘤靶點提供數(shù)據支撐。
通過先進的單細胞TCR測序技術，分析發(fā)現(xiàn)經抗PD-1/GITR抗體聯(lián)合免疫治療后，
克隆擴增的CD8+ T細胞群具有獨特的基因表型特征
為了更好的進行后續(xù)實驗探索，研究者們設計了一套實驗進行單細胞TCR測序分析，首先荷瘤小鼠在第6天接受抗體藥物治療，在治療后的第2天與第5天，取腫瘤細胞和脾臟，流式分選CD8+T細胞，通過Fluidigm公司C1系統(tǒng)進行單細胞TCR測序（圖2A）。如圖2B所示，通過對T細胞功能障礙和激活相關的452個基因進行分析，繪制熱圖分為6組，P值以0.05為界限，P值越小，對應基因表達譜差異性越顯著，數(shù)據顯示抗PD-1抗體與抗GITR抗體聯(lián)合治療主要在熱圖的第6組，同時說明不同抗體治療作用CD8+ T細胞所表現(xiàn)出的基因圖譜是不同的。
如圖2C所示，進一步研究發(fā)現(xiàn)，抗PD-1抗體、抗GITR抗體以及抗PD-1抗體與抗GITR抗體聯(lián)用這三種方式，均可以上調T細胞活化的標志物IL-12rb，與單個抗體藥物治療不同的是，抗PD-1抗體與抗GITR抗體聯(lián)合治療可選擇性的抑制一系列促T細胞功能性障礙相關基因（Mt1，Mt2和Cd200等）的上調，并大幅度上調Cd226基因，一種抗腫瘤反應中重要的共刺激分子。圖2C中紅色、紫色、藍色圓點分別代表PD-1抗體與GITR抗體聯(lián)用、PD-1抗體、GTIR抗體治療過程中，CD8+T細胞群特殊上調的表型基因。在這個過程中，CD8+ T 細胞群呈現(xiàn)出不同表型基因的上調，橫縱坐標分別代表基因活性積分與功能障礙積分，橫坐標越往右側，與T細胞活化相關基因上調越明顯。通過圖2D整合分析進一步說明，PD-1抗體與GITR抗體聯(lián)用和單一抗體治療相比較，聯(lián)合治療對T細胞活化相關基因有明顯的上調作用。
圖2. 單細胞測序繪制CD8+ T細胞獨特的基因圖譜及分析
進一步研究揭示，抗PD-1抗體與抗GITR抗體聯(lián)合免疫治療介導形成獨特的腫瘤特異性CD8+ T細胞群
如圖3A所示，取經抗PD-1抗體、抗GITR抗體以及兩種抗體聯(lián)合分別處理的荷瘤小鼠，在處理后的9天和12天，取瘤內T細胞，進行相關maker標記（PD-1、TIM3、LAG3、KLRG1，CD244和CD44），根據不同標記物的表達情況，繪制瘤內T細胞群。結果顯示，經抗GITR抗體，抗PD-1抗體與GITR抗體聯(lián)合治療后，抗原特異性CD8+ T細胞在T細胞的不同分化階段表現(xiàn)出一定的異質性。將各maker異質性細胞群密度圖整合分析，發(fā)現(xiàn)形成的14號12號和7號細胞集群對PD-1抗體和GITR抗體聯(lián)合治療具有高度響應，同時揭示14號細胞集群的出現(xiàn)預示T細胞功能障礙到達終點（早期并未形成14號細胞集群）（如圖3B-G）。
圖3. 抗體聯(lián)合治療后，對功能性障礙的腫瘤浸潤CD8+ T細胞群的鑒定
雖然經過以上研究，發(fā)現(xiàn)了腫瘤特異性CD8+ T細胞群，但這并不能說明PD-1抗體與GITR抗體聯(lián)合治療的長效性。
為了找到抗體聯(lián)合治療的長效性的原因，研究者們隨后對T細胞群進行表征分析，利用更多的T 活化與分化過程中的標志物對T細胞進行標記，做深度剖析（圖4A-B）。經SPADE集群分析顯示（圖4C-E），由抗GITR抗體驅動的免疫聯(lián)合治療12天后，瘤內出現(xiàn)了特殊的記憶性細胞群，此細胞群的形成標志著獲得性免疫的開啟，維持抗體聯(lián)合免疫治療的長效性（圖4F-G）。
圖4. 抗體聯(lián)合治療后，對記憶性CD8+ T細胞群的鑒定
到目前研究節(jié)點上，我們已經了解到，雖然PD-1抗體很少引起T細胞功能障礙，但卻不能保持免疫治療的長效性。而GITR抗體與PD-1抗體的聯(lián)合免疫治療中，瘤內出現(xiàn)了記憶性的CD8+ T細胞群解釋了先前研究者對聯(lián)合療法長效性的困惑。
在抗PD-1/GITR聯(lián)合療法中CD226廣泛表達在腫瘤特異性的CD8+T細胞群中
為了進一步研究抗PD-1抗體與抗GITR聯(lián)合療法協(xié)同作用于CD8+T細胞群的內在機制，科學家們開始對前文提到的CD226共刺激分子的表達進行深度研究。如圖5A所示，在經兩種抗體聯(lián)合治療后，CD226 mRNA在腫瘤內不同的CD8+T細胞群上廣泛性存在。進一步研究發(fā)現(xiàn)，經PD-1抗體治療的MC38小鼠模型，其脾細胞中的抗原卵白蛋白（OVA）特異性的CD8+T表達的CD226蛋白質最高，說明在抗腫瘤過程中，PD-1抗體的治療對驅動CD226表達的抗原特異性T細胞發(fā)揮了關鍵性的作用（圖5B）。
如上文提到PD-1抗體治療中擁有這么關鍵的作用，那么PD-1信號通路與CD226之間會存在怎樣的聯(lián)系呢？與已確定的PD-1–SHP2 脫磷酸化靶點CD28（共刺激受體）比較，在淋巴細胞功能相關抗原-1（LFA-1）存在情況下，CD226可通過PD-1–SHP2進行劑量依賴性脫磷酸化（圖5C）。PD-1抗體處理組結果顯示，CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）中CD266出現(xiàn)高度的磷酸化現(xiàn)象，而對照組CD266無磷酸化出現(xiàn)，說明瘤內PD-1/PD-L1通路在CD8+T細胞對CD266起負調控作用。以上數(shù)據揭示CD266是PD-1–SHP2脫磷酸作用的另一位關鍵靶點。（如圖5D-E）
圖5. 在小鼠MC38腫瘤模型上進行抗PD-1與抗GITR抗體聯(lián)合治療中，CD226介導抗腫瘤反應的研究
為了進一步驗證CD266是抗PD-1與抗GITR抗體聯(lián)合療法中介導抗腫瘤的關鍵因素，研究者在CD266抑制劑處理過的荷瘤小鼠以及CD266基因敲出的荷瘤小鼠身上應用抗PD-1抗體與抗GITR抗體聯(lián)合療法，結果此療法并未發(fā)揮抗腫瘤活性，也沒有改善小鼠的生存期（圖5G），而通過阻斷TNFR超家族信號途徑和CD28分子均未影響兩種抗體聯(lián)合療法的抗腫瘤作用。這為CD266在PD-1抗體與GITR抗體聯(lián)合療法中介導抗腫瘤作用提供了有力證據。
當然一切好的科研成果一定是基于大量的實驗研究的，這不，科學家們隨后用RECNA（小鼠腎癌）模型進一步驗證CD266分子在抗PD-1與抗GITR抗體聯(lián)合治療中的關鍵性作用，實驗數(shù)據顯示與前文MC38小鼠模型上研究得到的結論高度吻合（圖6）。
圖6.在小鼠RECNA腎癌模型上進行PD-1/GITR抗體聯(lián)合治療中，CD226介導抗腫瘤反應的研究
好了，以上就是對本文做的簡要回顧。
總結起來，雖然PD-1抗體與GITR抗體各成一派，但兩者卻又強強聯(lián)合，其聯(lián)合治療過程中不僅提高CD266活化表達，并且有效的促進效應記憶細胞的增殖，維持抗腫瘤的長效性，進而發(fā)揮抗腫瘤作用。
而這些耀眼的數(shù)據，令人驚嘆的結果都是基于科學的研究方法和有力的小鼠模型。
百奧賽圖已經自主開發(fā)出B-hPD-1/B-hGITR雙免疫檢查點人源化小鼠，并在此前的研究工作中分別對單免疫檢查點B-hPD-1和B-hGITR人源化小鼠進行了大量體內相關藥效驗證（如圖7，8）。B-hPD-1/B-hGITR更適合對人的PD-1抗體與GITR抗體藥物進行體內藥效評價（目前正在進行藥效驗證），并且文章中提到的藥效動力學中的TILs研究也是本公司特色的體外檢測服務平臺之一。如有需要，歡迎小伙伴們前來咨詢及合作！
圖7. PD-1(Keytruda)抗體與化療藥物聯(lián)用體內藥效
將小鼠結腸癌MC38細胞（人源化PD-L1并去除小鼠PD-L1）移植到B-hPD-1純合小鼠體內建立皮下腫瘤模型，待腫瘤體積約150±50mm3時將動物分組(n=8)。
結果顯示：抗人PD-1抗體Keytruda和化療藥物Cisplatin聯(lián)合用藥組與單獨用藥組相比表現(xiàn)出更為明顯的腫瘤抑制效果，證明B-hPD-1小鼠是評估人PD-1抗體與化藥聯(lián)合用藥體內藥效的有力工具。 A. 腫瘤平均體積±SEM，B. 小鼠平均體重±SEM。
圖8.利用B-hGITR小鼠進行抗人GITR抗體藥效驗證實驗
將小鼠結腸癌細胞MC38移植到B-hGITR雜合小鼠皮下，待腫瘤體積約150±50mm3時將動物入組至對照組和治療組(n=6) 。
結果顯示：相同劑量下，不同抗人GITR抗體對腫瘤生長有不同程度的抑制作用。 A. 腫瘤平均體積±SEM，B. 小鼠平均體重±SEM。結果證明：B-hGITR小鼠是評估人GITR抗體體內藥效的有力工具。
參考文獻
Wang B, Zhang W,Jankovic V，et al. Combination cancer immunotherapy targeting PD-1 and GITR can rescue CD8+ Tcell dysfunction and maintain memory phenotype. Sci Immunol. 2018 Nov 2;3(29). pii: eaat7061.
