轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品數(shù)字PCR檢測方法

       本標準按照GB/T 1.1-2009給出的規(guī)則起草。
       本標準由全國生化檢測標準化技術委員會（SAC/TC 387）提出并歸口 。
       本標準主要起草單位 ： 中國檢驗檢疫科學研究院、廣西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心 、中國農(nóng)業(yè)大學 、中國農(nóng)業(yè)科學院油菜作物研究所。
      本標準主要起草人：付偉 、杜智欣 、 王勤 、 王輩煌 、許文濤 、 吳剛 、朱水芳 、 劉曉飛 。
 
1 范圍
       本標準規(guī)定了轉(zhuǎn)基因成分檢測的數(shù)字PCR方法。
       本標準適用于玉米、大豆、油菜、水稻、馬鈴薯、苜蓿、棉花等轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因成分數(shù)字PCR檢測。
       本標準所能達到的檢測低限為0.1%（質(zhì)量分數(shù)）。
2 規(guī)范性引用文件
      下列文件對于本文件的應用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
GB/T 6682         分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法
GB/T 19495.1    轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 通用要求和定義
GB/T 19495.3    轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 核酸提取純化方法
GB/T 19495. 7   轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 抽樣和制樣方法
3 術語和定義
       下列術語和定義適用于本文件。
3.1
       18srRNA基因 18srRNA gene
       轉(zhuǎn)錄自18srDNA.是細胞核糖體的組分之。
3.2
       CaMV35s啟動子基因 CaMV35s promotor
       來自花椰菜花葉病毒（Cauliflower mosaic virus，CaMV）的35s啟動子。
3.3
       NOS終止子基因 NOS terminitor
       來自胭脂堿合成酶基因NOS的終止子。
4 原理
       數(shù)字PCR其技術原理是通過將原始PCR反應體系進行分割，進而對所有小的反應體系進行擴增并后續(xù)檢測。 通過對反應體系進行有限的分割，從而使整個反應體系可以更加耐受核酸抑制因子，并且更加穩(wěn)定、準確、快速地對痕量的轉(zhuǎn)基因成分進行精準鑒定。
       現(xiàn)階段數(shù)字PCR的實現(xiàn)形式包括芯片式數(shù)字PCR與做滴式數(shù)字PCR兩種。 其中芯片式數(shù)字PCR通過微流控芯片實現(xiàn)對原始反應體系的分割，這種分割方式具有穩(wěn)定性好均一性好的優(yōu)點，但是這種分割方式的實驗成本相對較高；微滴式數(shù)字PCR平臺通過產(chǎn)生微小油包水體系實現(xiàn)反應體系的分割。 這種分割方式具有反應速度快．分割成本低的優(yōu)點，但是相對來說，這種分割方法的穩(wěn)定性較差，而且對于數(shù)據(jù)分析的要求也相對較高 。 由于數(shù)字PCR的平臺差異，對不同數(shù)字PCR平臺進行的數(shù)據(jù)協(xié)同分析也成為了目前數(shù)字PCR檢測方法發(fā)展的關鍵。
       本標準針對通用篩選元件CaMV35s啟動子和NOS終止子設計選取特異性引物和探針進行數(shù)字PCR擴增，并根據(jù)擴增結(jié)果來判定CaMV35s啟動子和NOS終止子的外源篩選元件成分。 另外，通過芯片式數(shù)字PCR和微滴式數(shù)字PCR的協(xié)同比對，本標準方法可以在兩種平臺中達到同樣的檢測目的 。
5 試劑與材料
       除非有特殊說明，僅使用分析純試劑和符合GB/T 6682規(guī)定的一級水 。
5.1 DNA提取試劑盒
       推薦針對不同的樣品基質(zhì)類型選取不同的基因組提取試劑盒。
5.2 數(shù)字PCR反應試劑盒
       推薦按照不同的數(shù)字PCR平臺的說明書選取其推薦的數(shù)字PCR反應試劑盒。
5.3 18srRNA基因引物和探針
       18s-F:5’-CCTGAGAAACGGCTACCAT'-3’
       18s-R:5’-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3’
       18s-P:5’-VIC-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-BHQ1-3’
5.4 CaMV35s啟動子基因引物和探針
      p35s-F: 5'-ATTGATGTGATATCTCCACTGACGT-3'
      p35s-R: 5'-CCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCT-3'
      p35s-P: 5 '-VIC- CCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCT-BHQ1-3 '
5.5 NOS終止子基因引物和探針
      TNOS-F: 5'-ATCGTTCAAACATTTGGCA-3'
      TNOS-R: 5'-ATTGCGGGACTCTAATCATA-3'
      TNOS-P,5 '-VIC-CATCGCAAGACCGGCAACAGG-BHQ1l-3'
6 儀器與設備
6.1分析天平：感量0.1 mg。
6.2生物安全柜
6.3數(shù)字PCR擴增儀。
6.4純水儀。
6.5核酸定量儀。
6.6渦旋震蕩儀。
6.7其他相關儀器和設備。
6.8離心管。
6.9 不同量程移液器以及配套吸頭如下：
a)量程為 20 µL～200 µI， 10 µL～100 µL 和 2 µL～20 µL 的移液器以及配套的 200 µL 吸頭；
b)量程為 0.5 µL～10 µL 和 0.1µL～2.5 µL 的移液器以及配套的 10µL吸頭。
7 操作步驟
7. 1 抽樣
       按照 GB/T 19495.1和GB/T 19495.7 的規(guī)定執(zhí)行。
7.2 制樣
       按照 GB/T 19495.1 和 GB/T 191195.7 的規(guī)定執(zhí)行。
7.3 試樣預處理
       按照 GB/T 19495.1 和 GB/T 19195.3 的規(guī)定執(zhí)行。
7.4 DNA模板制備
       按照 GB/T 19495.1 和 GB/T 19495.3 的規(guī)定執(zhí)行。
7.5 數(shù)字PCR擴增方法
7 .5. 1 試樣數(shù)字 PCR 反應
7.5.1.1 內(nèi)標準基因數(shù)字 PCR 反應
       每個試樣內(nèi)標準基因數(shù)字 PCR 反應設置 3 個平行。 并按照表 1 的組分和終濃度配置數(shù)字 PCR 反應體系。 反應體系配置完成后，進行反應體系的分割，其中芯片法數(shù)字 PCR 通過微流控芯片實現(xiàn)本步驟，微滴法數(shù)字PCR通過形成油包水結(jié)構實現(xiàn)體系的分割。 該步驟按照不同數(shù)字 PCR 平臺的說明書進行操作。 數(shù)字PCR反應的有效分割體系數(shù)不得低于理論分割體系數(shù)的60%。

試劑	終濃度	體系
2×反應Mix	l×	2 .uL
20 µmol/L, zSSIIb-F/p35s-F/ TNOS-F	0.45 µmol/L	0.09 µL
20 µmol/L,  zSSIIb-R/p35s-R/ TNOS-R	0.45 µmol/L	0.09 µL
20µmol/L, zSSIIb-P/p35s-P/ TNOS-P	0.1 µmol/L	0.02 µL
50 ng/ µL DNA模板	12.5 ng/µL	1 µL
水		補齊4 µL
總體系		4 µL
推薦市面上現(xiàn)售的數(shù)字PCR平臺進行實驗，并針對市面上現(xiàn)售的不同數(shù)字PCR平臺，依據(jù)說明書調(diào)整反應體系的組分和最終體積，并保證表中所列組分的終濃度不變。

體系分割完成后，進行數(shù)字PCR反應。 熒光分析步驟采用VIC單熒光通道，反應程序如表2 所示。

步驟	溫度	持續(xù)時間	循環(huán)數(shù)
熱激活	50 ℃	2 min	1
	95 ℃	5 n1in
變性	95 ℃	15 s	40
退火延伸	60 ℃	1 min
注：不同PCR反應平臺可以根據(jù)說明書對熱啟動步驟程序進行修改，但是不能對擴增程序進行修改。

 
7.5.1.2 外源基因p-35s與T'-NOS基因數(shù)字PCR反應
       每個試樣外源基因數(shù)字PCR反應設置3個平行。 外源基因擴增所用反應體系與反應程序與7.5.1.1相同，擴增所使用的引物探針為5.4與5.5所述引物探針。
7.5.2 對照數(shù)字PCR反應
       在試樣數(shù)字PCR的同時．應設置陰性對照與空白對照。
以與試樣相同種類的非轉(zhuǎn)基因植物基因組DNA作為陰性對照；以水作為空白對照。
各對照PCR反應體系中，除模板外，其余組分及PCR反應條件與7.5.1相同。
8.結(jié)果分析與表述
8. 1 闊值的設定
       根據(jù)數(shù)字PCR結(jié)果中擴增曲線的基錢或者體系中陰性分割體系的終點熒光值設定熒光的闊值限。 闊值限需要對陰性和陽性擴增結(jié)果進行明顯的區(qū)分。
8.2 對照組檢測結(jié)果分析
       陰性對照組只有內(nèi)標準基因的擴增，空白對照組沒有任何擴增現(xiàn)象，這表明數(shù)字PCR反應體系正常工作，否則需要進行重新檢測 。
8.3 試樣檢測結(jié)果分析和表述
8. 3. 1 內(nèi)標準基因得到了明顯的擴增，并且外源p-35s或NOS基因的任何一個出現(xiàn)明顯的擴增現(xiàn)象， 陽性擴增體系內(nèi)擴增曲線形狀良好或者其終點熒光信號值超過熒光閣值，這表明試樣中檢測出了p-35s 或T-NOS基因，表述為“試樣中檢測出了p-35s或NOS基因成分，檢測結(jié)果為陽性”。
8.3.2 內(nèi)標準基因得到了明顯的擴增，且其擴增曲線形狀良好并超過闊值限，而p-35s或T-NOS基因都沒有得到擴增，擴增終點熒光信號值位于闊值限之下，這表明試樣中未檢測出p-35s或T-NOS基因成分，表述為“試樣中未檢測出p-35s或T-NOS基因成分，檢測結(jié)果為陰性” 。
8.3.3 內(nèi)標準基因沒有得到擴增，擴增終點熒光信號值位于闊值限之下，這表明試樣中未檢測對應植物成分，結(jié)果表述為“試樣未檢出對應植物成分，檢測結(jié)果為陰性’。