使用GC/ICP-MS對(duì)生物組織中有機(jī)錫化合物進(jìn)行形態(tài)分析

使用GC/ICP-MS對(duì)生物組織中有機(jī)錫化合物進(jìn)行形態(tài)分析

引言

由于有機(jī)錫在農(nóng)業(yè)， 工業(yè)和家庭中被廣泛使用， 因此其對(duì)環(huán)境的影響受到了極大的重視[1]。 丁基錫和苯基錫已被廣泛用作活性殺生物劑， 在防污涂料、 聚氯乙烯（PVC） 穩(wěn)定劑、木材處理， 以及其他方面都有應(yīng)用[2]。 例如， 當(dāng)被用于防污涂料時(shí)， 痕量水平（ppt） 的丁基錫和苯基錫將會(huì)對(duì)非靶標(biāo)生物造成嚴(yán)重?fù)p害， 并在沉積物和生物群中累積[3-4]。 因此， 歐盟（EU） 將三丁基錫（TBT） 及其降解產(chǎn)物列入到優(yōu)先控制污染物名單中（修訂水框架指令2000/60/EC的決定2455/2001/EC） [4]。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（EPA） 對(duì)TBT建立了環(huán)境水生生物水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)， 其中防止海洋水生生物免受慢性毒作用的標(biāo)準(zhǔn)值是3 ng Sn/L， 而免受急性毒作用的標(biāo)準(zhǔn)值則為172 ng Sn/L[4]。 由于TBT、 三苯基錫（TPhT） 以及它們的降解產(chǎn)物（二取代錫，單取代錫和無(wú)機(jī)錫） 各自的毒性存在差異， 而且對(duì)環(huán)境影響的監(jiān)測(cè)也不相同，因而非常有必要對(duì)有機(jī)錫的形態(tài)進(jìn)行分析[5]。

如今， 由于氣相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜（GC/ ICP-MS） 聯(lián)用法具有靈敏度高， 選擇性好， 可以同時(shí)分析多種元素和多種同位素等優(yōu)勢(shì)， 因此成為了金屬有機(jī)物痕量分析的首選方法[3]。 通過(guò)GC/ ICP-MS開(kāi)展有機(jī)錫形態(tài)分析， 為了增加各形態(tài)的揮發(fā)性， 需要加入四丙基硼酸鈉或四乙基硼酸鈉進(jìn)行衍生化反應(yīng)。 此外， 對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)， 如生物組織和沉積物的分析， 在有機(jī)錫化合物衍生前需要進(jìn)行軟提取， 以保持分析物的形態(tài)不發(fā)生改變。 開(kāi)放微波提取由于具有快速和高效的優(yōu)點(diǎn)， 是最流行的提取方法[3]。 本實(shí)驗(yàn)使用GC/ ICP-MS（CLARUS®GC和NexION®ICP-MS） 對(duì)有機(jī)錫形態(tài)進(jìn)行分析， 更具體地說(shuō)， 是通過(guò)外標(biāo)法對(duì)生物樣品中的單丁基錫、 二丁基錫和三丁基錫進(jìn)行分析。 而且在實(shí)驗(yàn)中特別注意了對(duì)連接GC和ICP-MS的GC傳輸線參數(shù)的優(yōu)化。 

實(shí)驗(yàn)條件

試劑和化學(xué)品
甲基三氯化單錫（MMT， 97％） ， 二甲基二氯化錫（DMT， 97％） ， 三甲基氯化錫（TMT， 97％） ， 三 氯 化 一 丁 基 錫 （MBT ， 95 ％ ） ， 二 氯 化 二丁基錫（DBT， 97％） ， 和三丁基氯化錫儲(chǔ)備溶液（TBT， 96％） 均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司™， 并使用冰乙酸（HAc） （GFS化工） 配制。 使用四丙基硼酸鈉(NaBPr4) (Merseburger Spezialchemikalien, 德國(guó)) 進(jìn)行衍生化。 衍生化過(guò)程中使用的緩沖溶液(0.1M, pH 4.9) 由MQ水溶解醋酸鈉和冰乙酸（HAc） 制得。 HPLC級(jí)異辛烷和Optima級(jí)甲醇（MeOH） 購(gòu)自Thermo Fisher Scientific™。
高純度的氫氧化銨（NH 4 OH） 、 硝酸（HNO3 ） 、 鹽酸（HCl） 的氫氧化四甲基銨（TMAH， 25％）
均購(gòu)自GFS化工（GFS Chemicals） 。 在本實(shí)驗(yàn)中使用的標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)貽貝組織（CRM477） 購(gòu)自標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)和測(cè)量研究所（IRMM； 比利時(shí)基爾） ， 而牡蠣組織樣品則來(lái)自法國(guó)阿卡雄灣（Arcachon Bay） 。 

儀器
使用PerkinElmer® Clarus 580氣相色譜與NexION 300D電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS） 聯(lián)用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的分析工作， GC與ICP-MS的連接通過(guò)PerkinElmer GC/ICP-MS傳輸線實(shí)現(xiàn)（見(jiàn)圖1） 。 將配有一個(gè)內(nèi)失活毛細(xì)管柱的Silcosteel®管傳輸線插入到石英炬管和中心管中。 對(duì)干式等離子體條件下儀器工作條件（如： 內(nèi)失活的毛細(xì)管柱的距離、 Ar氣組成和氧氣（O2） 流速） 的優(yōu)化進(jìn)行了評(píng)價(jià)。 使用一臺(tái)SP-D Discover聚焦微波系統(tǒng)（CEM公司， 美國(guó)北卡羅萊納州馬修斯）從基質(zhì)中提取有機(jī)錫。 儀器操作條件詳見(jiàn)表1。 使用NexION ICP-MS和 Chromera® CDS軟件完成數(shù)據(jù)的收集和分析。

樣品制備
樣品制備， 微波萃取和衍生化均已有文獻(xiàn)資料記載[3-4]。甲基錫和丁基錫的儲(chǔ)備溶液（1000微克/毫升） 使用濃
的冰醋酸制備。 工作溶液使用1% HCl將貯備溶液按比例進(jìn)行稀釋得到， 每日現(xiàn)配， 并低溫保存。 標(biāo)準(zhǔn)系列各標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)測(cè)定3次后得到校準(zhǔn)曲線。 對(duì)于衍生化，稱取大約4.4克乙酸鈉， 加入1.0毫升醋酸， 然后使用MQ水溶解并定容至500mL， 配制成醋酸鹽緩沖溶液(0.1M, pH 4.9)。 此外， 使用MQ水配制2.5% 的NaBPr4溶液作為衍生化試劑， 并于暗處保存。 

微波萃取
在對(duì)貽貝和牡蠣組織中有機(jī)錫化合物進(jìn)行微波萃取時(shí)， 分別在10mL提取小瓶中加入0.15 g干樣， 然后再向干樣中加入4 mL 25% TMAH。 在每個(gè)提取小瓶中加入1個(gè)小的磁力攪拌棒， 以保證萃取過(guò)程中漿液的充分均勻化。 微波消解后， 根據(jù)需要， 可以對(duì)樣品進(jìn)行離心， 然后將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的小瓶中， 并在冰箱中儲(chǔ)存， 待測(cè)。 本實(shí)驗(yàn)使用的微波程序詳見(jiàn)表2. 

衍生程序
在20 mL玻璃小瓶中進(jìn)行衍生化。 首先， 將5mL的醋酸鹽緩沖液分別加入到已加入20， 50， 100和200μL含有5 ng / mL有機(jī)錫的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中。 根據(jù)需要， 使用HCl或NH4OH將各溶液的pH值調(diào)至5.0。 然后向小瓶中加入1mL異辛烷和250μL 2.5％的NaBPr4， 蓋好瓶蓋，并手動(dòng)振搖5分鐘。 然后將有機(jī)相轉(zhuǎn)移到GC小瓶中進(jìn)行分析。 以相同的方式制備3個(gè)空白溶液， 一方面可以進(jìn)行檢出限測(cè)定， 另一方面也可以發(fā)現(xiàn)樣品制備過(guò)程中可能發(fā)生的任何污染的特征。 對(duì)于生物組織的分析， 分別將30μL的貽貝組織和300μL的牡蠣組織提取液加入5毫升緩沖液， 并使用HCl或NH4OH將溶液的pH值調(diào)至5.0。 然后， 分別向小瓶中加入1mL的異辛烷和500μL的2.5％NaBPr， 蓋好瓶蓋， 并手動(dòng)振搖5分鐘。 將有機(jī)相轉(zhuǎn)移到GC小瓶中進(jìn)行分析。 圖2概述了本實(shí)驗(yàn)樣品制備過(guò)程的流程。 

在清潔的條件下工作對(duì)于低濃度分析的成功是非常重要的。 容器均使用洗滌劑進(jìn)行清洗， 然后分別用硝酸和鹽
酸浸泡（10％V： V， MQ水） ， 不同酸浸泡后使用MQ水沖洗。 清洗完成后， 將容器置于層流罩下干燥保存， 待用。 

結(jié)果與討論

GC傳輸線優(yōu)化
操作參數(shù)的優(yōu)化主要涉及GC輸送線和ICP-MS炬管， 如內(nèi)毛細(xì)管柱距離， Ar組成氣流速（即霧化氣） 和氧氣（O2） 的加入， 分別使用載氣氦（He） 的氮?dú)猓?/SPAN>N2）雜質(zhì)（同位素15） 連續(xù)信號(hào)進(jìn)行評(píng)估。 O2的添加是必要的， 以防止異辛烷在ICP-MS采樣錐產(chǎn)生積碳[5]。 雖然本實(shí)驗(yàn)使用15N+的響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化， 在之前的研究中還有使用氙氣/氬氣混合氣（50ppm） 的報(bào)道[6]。

PerkinElmer提供的GC傳輸線， 可用于CLARUS或 AutoSystem ™ GC ， 也可用于CLARUS 或AutoSystem™GC與NexION或ELAN®的ICP-MS平臺(tái)的聯(lián)用。 CLARUS GC系統(tǒng)對(duì)GC傳輸線的溫度進(jìn)行控制， 以維持傳輸線中的分析物處于氣相， 并防止出現(xiàn)冷點(diǎn)[7]。 Ar氣流速由ICP-MS霧化器控制， 并在進(jìn)入傳輸線前進(jìn)行加熱。 足夠的流量對(duì)于待測(cè)物質(zhì)有效的傳送到等離子體中是很重要的。 通過(guò)三通（“T” 加入）氧氣， 而且氧氣同樣要通過(guò)傳輸線。 儀器設(shè)定完成后點(diǎn)炬， 測(cè)定15N+響應(yīng)值， 并根據(jù)15N+響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)前期的工作， O2氣加入量和內(nèi)失活毛細(xì)管柱位置的優(yōu)化值（距離傳輸線中Silcosteel®管末端的相對(duì)位置） 分別為0.025 L/min 和 7 cm[7]。 通過(guò)在0.8-1.0 L/min 范圍內(nèi)改變Ar組成氣（O2流量為0.025 L/min）氣流量， 當(dāng)觀察到5N+響應(yīng)值最大時(shí)， 確定最優(yōu)Ar組成氣氣流量。 在確定好最優(yōu)條件后， 注入有機(jī)溶劑（例如， 異辛烷， 己烷， 丙酮等） ， 以確保待測(cè)物質(zhì)能夠進(jìn)入等離子體。 圖3為注入異辛烷時(shí)5N+同位素信號(hào)典型的相應(yīng)圖。 5N+基線信號(hào)在2.5分鐘時(shí)的抑制正好與有機(jī)溶劑在等離子體中的燃燒相對(duì)應(yīng)， 從而證明了GC氣體流滲透進(jìn)入到等離子體中。 GC/ICP-MS系統(tǒng)的最優(yōu)條件列于表1。 

分析性能
使用丁基錫標(biāo)準(zhǔn)溶液確定分析響應(yīng)特性。 Sn同位素（118， 119和120） 校正曲線的生成由重復(fù)三次注射1µL的標(biāo)準(zhǔn)溶液得到， 標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度范圍從0（即空白） 到2 ng/mL， 使用異辛烷溶液配制。由 120Sn響應(yīng)函數(shù)（圖4） 可見(jiàn)校準(zhǔn)曲線具有良好的線性度和令人滿意的相關(guān)系數(shù)（R 2值） 。 檢出限（LOD=3σblank/m） 則由每個(gè)校準(zhǔn)響應(yīng)函數(shù)得到，并且120Sn的MBT、 DBT 和 TBT的絕對(duì)檢出限分別為18， 200和7 fg。 DBT的絕對(duì)檢出限較高可能是因?yàn)榭瞻准堓^高， 而空白值高則與化學(xué)品制備過(guò)程中使用的容器和試劑所造成的污染有關(guān)。 這種現(xiàn)象很常見(jiàn)， 因?yàn)?/SPAN>DBT被用于工業(yè)合成塑料。 

 

色譜分離和方法驗(yàn)證
圖5a-c分別顯示了用異辛烷配制的0.25 ng / mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液、 牡蠣組織和標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)貽貝組織中有機(jī)錫（120Sn同位素） 各形態(tài)分離的色譜圖。 再方法的開(kāi)發(fā)過(guò)程中對(duì)多個(gè)Sn同位素（118， 119， 120） 進(jìn)行了監(jiān)測(cè)， 但為簡(jiǎn)單起見(jiàn)， 僅列出了120Sn的結(jié)果。 色譜條件（表1） 的選擇主要是按照使各形態(tài)物質(zhì)從溶劑洗脫物干擾區(qū)域分離的方式的進(jìn)行[1]。 存在于生物組織樣品中的丁基錫化合物的定量結(jié)果通過(guò)外標(biāo)法得到。 一式三份提取的貽貝組織標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)用于本實(shí)驗(yàn)方法的驗(yàn)證。 將實(shí)驗(yàn)測(cè)得的MBT， DBT和TBT值與認(rèn)證值進(jìn)行比較， 結(jié)果列于表3。 雖然牡蠣組織樣本中丁基錫形態(tài)物質(zhì)的濃度值沒(méi)有被標(biāo)定， 但由圖3還是可以看見(jiàn)其實(shí)驗(yàn)濃度值。 表1中列出的溫度程序?yàn)闄C(jī)錫化合物的有效分離提供了保證， 可以在不到11分鐘的時(shí)間里完成分離， 而且峰寬為2-3s。 圖5a為優(yōu)化條件下用異辛烷配制的含有甲基錫、 丁基錫形態(tài)物質(zhì)（質(zhì)量數(shù)為120） ， 濃度為0.25 ng / mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖。 通過(guò)圖5b和圖5c， 可以看見(jiàn)牡蠣和貽貝組織的色譜分離圖中還有其它在環(huán)境樣品中常見(jiàn)的有機(jī)錫形態(tài)物質(zhì)的存在， 如：一辛基錫、 二辛基錫、 一苯基錫、 二苯基錫、 三苯基錫等。 色譜圖中所有的峰型都能清楚的被識(shí)別。 8.5分鐘時(shí)出現(xiàn)的峰型可能是由于NaBEt的雜質(zhì)造成， NaBEt4是在衍生化階段加入的試劑， 這些雜質(zhì)可能會(huì)使得有機(jī)錫的形態(tài)物質(zhì)生成乙基化產(chǎn)物。 還需要開(kāi)展進(jìn)一步工作以證實(shí)這些物質(zhì)。

結(jié)論
本文提出了使用GC傳輸線聯(lián)接CLARUS GC和NexIONICP-MS檢測(cè)系統(tǒng)成果對(duì)生物組織進(jìn)行分析的方法。 丁基錫的形態(tài)具有良好的線性響應(yīng)函數(shù)， 在完成參數(shù)優(yōu)化后， 確定了儀器LODs。 將有機(jī)錫化合物的GC色譜分離應(yīng)用于貽貝組織標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)和牡蠣組織的分析。用外標(biāo)法對(duì)生物組織中丁基錫形態(tài)的定量和驗(yàn)證， 本實(shí)驗(yàn)得到的回收率≥92％， 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤14％。

參考文獻(xiàn)
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