國標(biāo)：蜂蜜中甲硝噠哇、 洛硝噠哇、 二甲硝咪哇殘留量的測定方法

中 華 人 民 共 和 國 國 家 標(biāo) 準(zhǔn)GB/T 18932. 26-2005

蜂蜜中甲硝噠哇、 洛硝噠哇、 二甲硝咪哇 殘留量的測定方法 液相色譜法
Method for the determination of metronidazole, ronidazole and
              dimetridazole residues i n honey               

蜂蜜中甲硝噠哇、 洛硝噠哇、 二甲硝咪哇          殘留量的測定方法              液相色譜法
范圍
    GB/T 18 9 32的本部分規(guī)定了蜂蜜中甲硝噠哇、洛硝噠哩、二甲硝咪哇殘留量的液相色譜測定 方法 。 本部分適用于蜂蜜中甲硝噠哇、 洛硝噠哇、 二甲硝咪哩殘留量的測定。 本部分的方法檢出限: 甲硝噠4、 洛硝噠哇、 二甲硝咪哇均為。. 010 mg /kg.
2 規(guī)范性 引用文件
    下列文件中的條款通過 GB/丁1 89 32的本部分的引用而成為本部分的條款。凡是注日期的引用文 件， 其隨后所有的修改單( 不包括勘誤的內(nèi)容) 或修訂版均不適用于本部分， 然而， 鼓勵(lì)根據(jù)本部分達(dá)成 協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的zui新版本。凡是不注日期的引用文件， 其zui新版本適用于本
部分 。    GB/T 6 37 9 測試方法的精密度 通過實(shí)驗(yàn)室間試驗(yàn)確定標(biāo)準(zhǔn)測試方法 的重復(fù)性和再現(xiàn)性 ( GB/T 63 79 -19 86, neq I S O 57 25; 1 98 1)    GB/T 6 68 2 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法( GB/T 66 8 2-19 92, n eq I SO 369 6: 19 87)
3 原理
    試樣中硝基咪哩類藥物殘留用乙酸乙醋提取， 提取液蒸干后， 用水溶解， 經(jīng)過 Oas i s HLB固相萃取 柱和BAKERBOND Carboxylic Acid固相萃取柱凈化， 液相色譜儀紫外檢測器測定， 外標(biāo)法定量。
4 試劑和材料
    除另有說明外， 所用試劑均為分析純， 水為GB/T 6 68 2規(guī)定的一級(jí)水。
4 .1 甲醇: 色譜純。 42 乙睛: 色譜純。 4 .3 乙酸乙醋: 色譜純。 4 .4 無水乙酸鈉: 分析純。 4 .5 bing乙酸: 優(yōu)級(jí)純。 4 .6 甲醇十水( (5 +95) : 量取 5 mL甲醇與 95 mL水混合。 4 .7 乙酸鹽緩沖溶液; 0.82 g/ L。稱取 0. 8 2 g無水乙酸鈉， 用 8 00 ml 一水溶解， 用bing乙酸調(diào)節(jié) pH至
4.3，用水稀釋至 1 L, 4 .8 洗脫劑:甲醇+乙睛+乙酸鹽緩沖溶液( 40+6+54) . 4 .9  Oasis HLB固相萃取柱或相當(dāng)者: 5 00 mg,6 mL。使用前分別用5 mL甲醇和 10 mL水預(yù)處理， 保持柱體濕潤。 4 . 1 0 BAKERBOND Carboxylic Acid固相萃取柱或相當(dāng)者: 5 0 0 mg,3 mL。使用前用 5 mL乙酸乙酷 預(yù)處理， 保持柱體濕潤。

4.1 1 甲硝噠哇、 洛硝噠哇、 二甲硝咪哇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì): 純度)9 8%. 4.1 2 甲硝噠哇、 洛硝噠哇、 二甲硝咪哇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液: 1. 0 mg/ mL。準(zhǔn)確稱取適量的甲硝噠哇、 洛硝 噠哇、 二甲硝咪哇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)， 分別用甲醇配成 1. 0 mg/ mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。儲(chǔ)備液可在溫度低于 4℃冰
箱中保存二個(gè)月。 4.1 3 甲硝噠嘩、 洛硝噠哩、 二甲硝咪哇混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液: 根據(jù)需要吸取適量甲硝噠哇、 洛硝噠哇、 二 甲硝咪哇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液， 用流動(dòng)相稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液， 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液應(yīng)現(xiàn)用
現(xiàn)配 。
5 儀器
5. 1 液相色譜儀: 配有紫外檢測器。 5. 2 分析天平: 感量。. 1 mg和0. 01 g各一臺(tái)。 5. 3 液體混勻器。 5. 4 固相萃取真空裝置 5. 5 振蕩器。 5. 6 具塞玻璃離心管: 5 0 ml , . 5. 7 真空泵: 真空度應(yīng)達(dá)到80 kPa, 5. 8 離心機(jī)。 5.9 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。 5. 1 0 樣品管:5 mL.
5. 11  pH計(jì) : 測量精度士0.0 2. 5. 12 梨形瓶 :200 ml 
6 試樣的制備與保存
3 .1 試樣的制備    對(duì)無結(jié)晶的實(shí)驗(yàn)室樣品， 將其攪拌均勻。對(duì)有結(jié)晶的樣品， 在密閉情況下， 置于不超過 6 0℃的水浴 中溫?zé)幔?振蕩， 待樣品全部融化后攪勻， 迅速冷卻至室溫。分出。. 5 kg作為試樣。制備好的試樣置于樣 品瓶中， 密封 ， 并做上標(biāo)記。
5.2 試樣保 存    將試樣于常溫下保存。
7 測定步 驟
7. 1 提取    稱取 6g試樣( 精確到 。. 01 g) 置于 50 MI具塞玻璃離心管中， 加人 6 mI 一水， 在液體混勻器上混 勻， 加 20 ml 一乙酸乙醋， 于振蕩器上振蕩 20 mi n， 離心， 取上清液至梨形瓶中。再用20 ml乙酸乙酷提 取一次， 合并上清液， 用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器于 45 ℃水浴上減壓蒸發(fā)至干， 用 5 ml水溶解， 待凈化。
7.2 凈化    將上述 5 mL水溶液移至 Oas i s HLB柱中，以小于等于 3 mL/ mi n的流速通過 Oas i s固相萃取柱 后， 用 5 mL水洗滌梨形瓶 ， 移至 Oas i s HLB柱中洗柱， 再用 5 mL甲醇+水(4 .6)洗柱， 棄去全部流出 液。在 65 kPa的負(fù)壓下， 減壓抽干20 mi n， 將 Oa s i s HLB柱下接Carboxylic Acid固相萃取柱， 用 5 MI 乙酸乙醋以小于等于3 mL/mi n的流速洗脫 Oa s i s HLB柱并通過 Carboxylic Acid固相萃取柱， 棄去 Oa s i s HLB柱， 分別用 5 ml乙酸乙醋和 5 mL乙睛洗滌 Carboxylic Acid固相萃取柱， 棄去全部流出 液。在 65 kPa的負(fù)壓下， 減壓抽干5 mi n， 用 2m工 一洗脫劑( ( 4 .8) 洗脫， 收集洗脫液于 5 mL樣品管中， 用洗脫劑定容至 2 mL， 供液相色譜儀測定。 7.3 測定 7. 3.1 液相色譜條件    a )色譜柱: Di a mo ns i l C, a , 5 pm, 250 mmX4.6 mm( 內(nèi)徑) 或相當(dāng)者;    b)流動(dòng)相: 乙睛+乙酸鹽緩沖溶液(1 0+9 0) ;    c)流速 :1. 0 mI ./mi n;    d)柱 溫 : 250 C;    e )進(jìn)樣量: 5 0 KL;    f )檢測波長: 315 nmo

7.3.2 液相色譜測定    用甲硝噠哇、 洛硝噠噢、 二甲硝咪哩混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣， 以峰面積為縱坐標(biāo)， 工作溶液濃度為橫 坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線， 用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量， 樣品溶液中甲硝噠哩、 洛硝噠哩、 二甲硝咪哇 的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器測定的線性范圍內(nèi)。甲硝噠哇、 洛硝噠哇、二甲硝咪哇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖參見 圖 A.1。 在上述色譜條件下， 甲硝噠哇、 洛硝噠哇、 二甲硝咪哇的參考保留時(shí)間見表 1,                      表 1 甲硝噠哇、 洛硝噠哩、 二甲硝咪哇的參考保留時(shí)間            硝基咪哇類藥物名稱 } 保留時(shí)間/ f l i 。 } 二 FP M r A qm m w A qE p A V * u t二牛 本方法的添加 回收率數(shù)據(jù)參見 附錄 Bo  平行試驗(yàn)
按 以上步驟 ， 對(duì) 同一試 樣進(jìn)行平行試驗(yàn)測定 。  空 白試驗(yàn)
除不稱取試樣外 ， 均按 上述步驟同時(shí)完成空 白試驗(yàn) 。
1 s. o
7.5
結(jié)果計(jì)算
結(jié)果按式( 1) 計(jì)算:
1 0 0 0 1 0 0 0 (1)
V一m
    C
  一 一  X
式 中: X- 試樣中被測組分殘留量， 單位為毫克每千克( mg/ kg); 從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的被測組分溶液濃度， 單位為微克每毫升( Rg/ mL) ; 樣品溶液最終定容體積， 單位為毫升( mL) ; m— 樣品溶液所代表最終試樣的質(zhì)量， 單位為克( 9) 。
注 :計(jì)算結(jié)果 應(yīng)扣除空白值
9 精密度
    本部分的精密度數(shù)據(jù)是按照GB/T 6 37 9的規(guī)定確定的， 重復(fù)性和再現(xiàn)性的值以 9 5%的可信度來 計(jì)算 。 9 .1 重復(fù)性    在重復(fù)性條件下， 獲得的兩次獨(dú)立測試結(jié)果的絕對(duì)差值不超過重復(fù)性限( r )， 蜂蜜中甲硝噠哇、 洛硝 噠哇、 二甲硝咪哩含量范圍及重復(fù)性方程見表 2,

表 2 含t范 圍及重 復(fù)性 和再現(xiàn)性方程
名 稱 含量范圍八mg/kg) 重復(fù)性 限 r 再現(xiàn)性 R
甲硝噠哇 0. 010^-0. 100 r=0. 030 3 m+2. 167 3 R=0.080 7 m+1. 040 8
洛硝噠哇 0. 010 0. 100 r =0.060 8 m+1. 872 7 R=0.062 0 m十1. 719 0
二甲硝咪哇 0. 010^0. 100 - 0.062 7 m+1. 441 1 I g R=O. 709 9 I g m-0. 437 7
注:。為兩次測定結(jié)果的算術(shù)平均值。
    如果差值超過重復(fù)性限， 應(yīng)舍棄試驗(yàn)結(jié)果并重新完成兩次單個(gè)試驗(yàn)的測定。
9. 2 再現(xiàn)性    在再現(xiàn)性條件下， 獲得的兩次獨(dú)立測試結(jié)果的絕對(duì)差值不超過再現(xiàn)性限( R)， 蜂蜜中甲硝噠哇、 洛 硝噠哇、 二甲硝咪哇的含量范圍及再現(xiàn)性方程見表20

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