腫瘤學(xué)必備——血管生成實(shí)驗(yàn)介紹

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實(shí)驗(yàn)原理
腫瘤血管生成是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，一般包括包括血管內(nèi)皮基質(zhì)降解、內(nèi)皮細(xì)胞移行、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、內(nèi)皮細(xì)胞管道化分支形成血管環(huán)和形成新的基底膜等步驟。無(wú)論原發(fā)性腫瘤還是繼發(fā)性腫瘤，一旦生長(zhǎng)直徑超過(guò)1~2 mm，都會(huì)有血管生成。這是由于腫瘤細(xì)胞自身可分泌多種生長(zhǎng)因子，誘導(dǎo)血管生成。多數(shù)惡性腫瘤的血管生成密集且生長(zhǎng)迅速。因此，血管生成在腫瘤的發(fā)展轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到重要作用，抑制這一過(guò)程將能明顯阻止腫瘤組織的發(fā)展和擴(kuò)散轉(zhuǎn)移。
體外的血管生成實(shí)驗(yàn)能很好的模擬腫瘤的血管發(fā)生過(guò)程，并且適合研究藥物對(duì)這一過(guò)程的影響實(shí)驗(yàn)。我們以HUVEC細(xì)胞為例，介紹這一實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)過(guò)程。

圖一血管生成鏡檢圖

一. 實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法
1. 實(shí)驗(yàn)材料

2. 實(shí)驗(yàn)方法：
2.1 實(shí)驗(yàn)流程介紹

圖二實(shí)驗(yàn)流程圖

（提前將Matrigel融化，鋪于ibidi血管生成載玻片的下孔中，待膠凝后，將細(xì)胞懸液加入血管生成載玻片上孔中，成管后使用顯微鏡觀察。）
2.2 耗材結(jié)構(gòu)介紹

圖三血管生成載玻片縱截面示意圖
（Matrigel鋪在下孔，細(xì)胞鋪在Matrigel上，上孔充滿培養(yǎng)基）

2.3 數(shù)據(jù)分析流程介紹

圖四實(shí)驗(yàn)結(jié)果收集和分析流程圖
（在特定的時(shí)間點(diǎn)采集圖片，并且進(jìn)行圖像分析（Wimasis全自動(dòng)分析）測(cè)量小管長(zhǎng)度，成環(huán)數(shù)，細(xì)胞覆蓋面積和結(jié)點(diǎn)。之后在對(duì)測(cè)量結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析以說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果。）
二. 實(shí)驗(yàn)步驟
1. 準(zhǔn)備基質(zhì)膠
1）.實(shí)驗(yàn)前一天將Matrigel置于冰盒中，放入4。C冰箱，使膠能過(guò)夜緩慢融化。（注意：同樣要準(zhǔn)備一些4。C預(yù)冷的槍頭用于吸取Matrigel）
2）.開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前，將Matrigel始終保持放在冰盒中。
3）.打開(kāi)滅菌包裝，取出ibidi血管生成載玻片。
4）.每孔中加入10μl Matrigel。注意槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方加入Matrigel，防止有Matrigel流經(jīng)上孔而留下殘留膠。

由于Matrigel流動(dòng)性不強(qiáng)，并且有可能移液槍不準(zhǔn)確，有可能打入10μl的膠，卻不能填滿血管生成載玻片的下孔——這樣，必然會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)的成像結(jié)果。
如何判斷是否加入了合適體積的Matrigel：
我們只需用一張格子紙就能知道自己的移液槍調(diào)整到多少能正好把下孔填滿。

如上圖所示，垂直透過(guò)每個(gè)孔看下面的格子紙，如果格子被縮小了，那么就說(shuō)明膠沒(méi)加滿，格子被放大了，那么膠就加多了，格子沒(méi)發(fā)生什么變形，這才是剛剛加滿下孔的狀態(tài)。
2. 凝膠
1）.蓋上ibidi血管生成載玻片的蓋子。
2）.準(zhǔn)備一個(gè)10cm的培養(yǎng)皿，放入浸過(guò)水的紙巾，制成一個(gè)濕盒。
3）.將ibidi血管生成載玻片放入培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋。
4）.將整個(gè)培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，靜置30分鐘左右，等待膠凝結(jié)。
5）.等待同時(shí)準(zhǔn)備細(xì)胞懸液。

3. 鋪細(xì)胞
加入細(xì)胞的量直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以在正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始之前，要對(duì)不同類型的細(xì)胞和使用數(shù)量進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。獲得最佳比例的細(xì)胞密度。我們今天的實(shí)驗(yàn)使用HUVEC細(xì)胞，每孔種10000個(gè)細(xì)胞即可。
1）.準(zhǔn)備密度為2*105cells/ml的細(xì)胞懸液，充分混勻。
2）.將膠已經(jīng)凝固的ibidi血管生成載玻片從濕盒中取出。
3）.每孔加入50μl的細(xì)胞懸液，注意保持槍頭垂直在上孔的上方，不要接觸下孔的凝膠�？梢允褂门艠尅�
4）.同樣用格子紙查看是不是加了足夠量的液體，如果沒(méi)有，加入無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)基，使上孔液體正好加滿。
5）.蓋上蓋，靜置，一段時(shí)間后，所有細(xì)胞都會(huì)沉下去落在Matrigel的表面。

4. 采集圖像并統(tǒng)計(jì)結(jié)果
可以按照細(xì)胞的生長(zhǎng)速度定時(shí)采集圖像，并且對(duì)其成管長(zhǎng)度，覆蓋面積，成環(huán)數(shù)，結(jié)點(diǎn)數(shù)進(jìn)行測(cè)量和記錄，并且對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

5. 免疫熒光染色
根據(jù)需要，可以對(duì)成管結(jié)果進(jìn)行免疫熒光染色。
1）.小心的移除上孔內(nèi)培養(yǎng)基，注意不要碰到膠或者細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。
2）.加入50μl用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的calcein (12.5 µl calcein stock 1 µg/µl)，使其終濃度為 6.25 µg/ml (1:160)。
3）.在室溫下避光孵育30分鐘。
4）.使用PBS清洗三次，注意，PBS要緩緩加入上孔，以免沖擊掉細(xì)胞。
5）.使用 485 nm/ 529 nm進(jìn)行免疫熒光成像。